Inmunofluorescencia y FISH Combinado de ADN en 3D conservados núcleos en interfase para estudiar los cambios en la organización nuclear 3D

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la detección simultánea de las modificaciones de histonas por secuencias de ADN de inmunofluorescencia y por FISH de ADN seguido por microscopía 3D y análisis (3D inmuno-ADN FISH).

Resumen

La hibridación fluorescente in situ con sondas de ADN sobre el 3-dimensional núcleos conservan seguido por microscopía confocal 3D (3D FISH AND) representa la forma más directa para visualizar la localización de loci de genes, cromosomas sub-regiones o territorios enteros en celdas individuales. Este tipo de análisis permite conocer la arquitectura global del núcleo, así como el comportamiento de los loci genómicos y regiones específicas dentro del espacio nuclear. Inmunofluorescencia, por otro lado, permite la detección de proteínas nucleares (histonas modificadas, variantes de histonas y modificadores, maquinaria de transcripción y factores nucleares, sub-compartimientos, etc.) El principal reto en la combinación de ADN FISH inmunofluorescencia y 3D es, por un lado, para preservar el epítopo detectados por el anticuerpo, así como la arquitectura 3D del núcleo, y por otra parte, para permitir la penetración de la sonda de ADN para detectar loci de genes o cromosomas territorios ^1-5. A continuación presentamos un protocolo que combina la visualización de las modificaciones de la cromatina con loci genómicos en los núcleos 3D conserva.

Introducción

Epigenética establecimiento de mecanismos de disparo y la herencia de desarrollo y el tipo de células perfiles de transcripción específicos. Por un lado se trata de la modulación de la cromatina embalaje que define regiones genómicas activas o en silencio. En una escala mayor, la organización global de 3D del genoma nuclear y de la arquitectura también desempeñar un papel en el control de los patrones transcripcionales. Por lo tanto, la disección de estas características epigenomic es esencial para una comprensión completa de cómo se regulan los genes ^6-11.

FISH Combinado de ADN de inmunofluorescencia y 3D ofrecen una oportunid....

Protocolo

1. Etiquetado de ADN Probe con fluoróforos: Nick Translation (~ 6 horas)

1. Clean BAC ADN (preparado por maxi-prep) o plásmidos o productos de PCR, todos resuspendió en H ₂ O, se puede utilizar para el etiquetado. Tenga en cuenta que para una señal de FISH robusto, sondas deberían abarcar al menos 10 kb.
2. Incubar ADN en RNasa A durante 30 min a 37 ° C (Todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1).
3. Incubar la reacción de traducción nick durante 2 horas a 16 ° C (véanse los cuadros 2 y 3). Los métodos alternativos de etiquetado directo puede ser utilizado (Ejemplo: Etiqueta FISH,....

Resultados

ADN y la inmuno-FISH se utilizan en el laboratorio Skok para estudiar los cambios en la organización nuclear asociados con el proceso de V (D) J recombinación de loci receptores de antígenos durante el desarrollo de linfocitos B y T. Las técnicas detalladas anteriormente nos permiten i) medir distancias entre los dos extremos de un locus (contracción) ii) medir distancias entre los alelos o loci (emparejamiento), iii) analizar el daño del ADN que ocurre dentro de loci, iv) evaluar la ubicación de los alelos y en relació.......

Discusión

Las técnicas detalladas anteriormente se han utilizado en nuestro laboratorio para analizar la regulación de V (D) J recombinación de la inmunoglobulina y loci TCRA / d en el desarrollo de los linfocitos ^30,31. Estamos seguros de que esta técnica se puede adaptar para la detección de varias proteínas nucleares, compartimentos nucleares y los loci, en diferentes tipos de células. Las modificaciones del protocolo puede ser necesaria, y en este caso los pasos principales de enfocar son los sigu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
H 2 O	Pescador	# BP2470
RNasa A	Sigma	# R4642
dNTP	Sigma	# DNTP100
Alexa dUTP	Invitrogen	# C11397 a C-11401
Cy3 o Cy5 dUTP	Pescador	º 45-001-xxx
DNasa I	Roche	# 04536282001
ADN Pol I	Biolabs	# M0209
0,025 micras filtros	Millipore	# VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg / ml	Invitrogen	# 18440
Hybloc ADN 1 mg / ml	Genética Aplicada	# MHB
De esperma de salmón	Sigma	# D1626	polvo que se volvieron a suspender a 10 mg / ml en H 2 O
NaAc (acetato de sodio, pH 5,2, solución tampón)	Sigma	# S7899
Ficoll 400 (Mol Biol. grado)	Pescador	# 525
Polivinilpirrolidona (Mol Biol. grado)	Pescador	# BP431
Polvo de sulfato de dextrano	Sigma	# D8906
SSPE (solución salina fosfato de sodio-EDTA) 20x solución	Pescador	# BP1328
Formamida	Pescador	# BP227
Cubreobjetos	Pescador	# 12-548-B
Diapositivas	Pescador	# 12-550
6-y las placas	Pescador	# 0720080
PBS, 10x	Pescador	# MT-46-013-CM
Poli-L-lisina	Sigma	# P8920
Paraformaldehído, gránulos, 95%	Sigma	# 441244
Triton-X-100, Mol Biol. grado	Sigma	# T8787
BSA (albúmina de suero bovino) fracción V	Pescador	# BP 1600
Suero normal de cabra	Vector Labs	# S-1000
Tween-20, Mol Biol. grado	Sigma	# P9416
SSC (citrato sódico salino) 20x solución	Pescador	# BP1325
Prolongar reactivo Antifade Oro	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	# D9542
Mejor prueba de una capa de cemento de goma	Arte o tiendas de suministros de oficina
			Tabla 1. Reactivos específicos y pequeños equipos.