Summary
Ein nicht-invasiver Mittel, um den Erfolg der Transplantation Myoblasten auszuwerten beschrieben. Das Verfahren nutzt ein einheitliches Fusionsprotein Reportergen, dessen Expression von Genen kann mit unterschiedlichen Bildgebungsverfahren abgebildet werden zusammengesetzt. Hier nutzen wir ein
Abstract
Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine schwere, genetisch bedingte neuromuskuläre Erkrankung, die 1 wirkt in 3.500 Jungen und zeichnet sich durch progressiven Muskelschwund 1, 2 gekennzeichnet. Bei Patienten, wird die Fähigkeit der Bewohner Muskel-Satelliten-Zellen (SCs), um beschädigte Muskelfasern regenerieren zunehmend ineffizient 4. Daher ist die Transplantation von Muskel-Vorläuferzellen (MPL) / Myoblasten von gesunden Probanden ein vielversprechender therapeutischer Ansatz zur DMD. Eine wesentliche Einschränkung auf die Verwendung von Stammzelltherapie ist jedoch ein Mangel an zuverlässigen bildgebenden Technologien zur Langzeitüberwachung von implantierten Zellen und zum Auswerten ihrer Wirksamkeit. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Echtzeit-Ansatz, um den Erfolg der Myoblasten Transplantation zu bewerten. Dieses Verfahren nutzt die Vorteile eines einheitlichen Reportergen-Fusion der Gene aus (Firefly Luziferase [fluc], monomere rot fluoreszierendes Protein [mRFP] und sr39 Thymidinkinase [sr39tk]), dessen Expression können mit unterschiedlichen Abbildungsmodalitäten 9, 10 abgebildet werden. Eine Vielzahl von bildgebenden Verfahren, einschließlich Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT), Kernspintomographie (MRI), optische Bildgebung, und Hochfrequenz 3D-Ultraschall sind nun mit jeweils eindeutigen Vorteile und Einschränkungen 11. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) Studien, zum Beispiel, haben den Vorteil, dass relativ geringen Kosten und hohem Durchsatz. Es ist aus diesem Grund, der in dieser Studie, nutzen wir der Firefly Luziferase (fluc) Reportergen Sequenz innerhalb des Fusionsgens und Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) für die kurzfristige Lokalisierung von lebensfähigen C2C12 Myoblasten enthalten nach der Implantation in eine Maus Modell DMD (Muskeldystrophie auf dem X-Chromosom [mdx] mouse) 12-14. Wichtig ist, bietet BLI uns ein Mittel, um die Kinetik der markierten MPCs nach der Implantation zu prüfen, und wird nützlich sein, um Zellen zu verfolgen wiederholt über time und nach der Migration. Unser Reporter-Gen Ansatz weiter ermöglicht uns, mehrere bildgebende Verfahren in einem einzigen lebenden Subjekt verschmelzen; angesichts der tomographischen Natur, feine räumliche Auflösung und die Fähigkeit zur Skalierung auf bis zu größeren Tieren und Menschen 10,11, wird PET bilden die Grundlage für die künftige Arbeit, dass wir schlagen kann ermöglichen eine schnelle Übersetzung von Methoden in Zellen präklinischen Modellen und klinische Anwendungen entwickelt.
Protocol
Ein. Erhaltung und Vermehrung der C2C12 Myoblasten
- Platte C2C12 Myoblasten in einem 75 cm 2-Kolben und aufrechtzuerhalten Zellen in hohen Glucose Dulbeccos modifiziertes Eagle-Serum (HG-DMEM) mit fötalem Rinderserum (FBS) in einer Endkonzentration von 10% ergänzt. Lassen Sie keine Zellen zu jederzeit konfluent, da dies die myoblastic Bevölkerung erschöpfen werden. . Immer warm mittel-bis 37 ° C in einem Wasserbad vor dem Gebrauch: Medium sollte jeden zweiten Tag Hinweis geändert werden.
- Wenn Myoblasten ca. 80% konfluent geworden, Passage-Zellen zu einer neuen Flasche. Absaugen Kulturmedium. Waschen der Zellen mit 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), um alle Spuren von Kulturmedium, die Trypsin-hemmende Serum enthält entfernen. Kurz spülen Zellschicht mit 2-3 ml 0,25% (w / v) Trypsin-EDTA-Lösung, um die adhärenten Myoblasten aus dem Kolben zu trennen. Absaugen Trypsin und Ort Kolben in Brutschrank bei 37 ° C für 5 min.
- Während dieser Inkubationtion, bereiten Sie einen neuen Kolben mit 9 ml HG-DMEM/10% FBS-Medium. Nach Trypsinisierung 10 ml Vollmedium zu den Zellen und Pipette 4-5 mal die Sammlung aller Zellen in dem Medium zu gewährleisten. 1 ml der Zellsuspension auf die neue Kolben und inkubieren in 5% CO 2 bei 37 ° C.
2. C2C12 Zelltransfektion
- Sobald Zellen haben 50% Konfluenz erreicht, transfizieren nach den Anweisungen des Herstellers von Invitrogen. Kurz gesagt, verbinden 90 ul Lipofectamin 2000 Reagenz mit 4,5 ml OPTI-MEM-Medium. In einem anderen Rohr verbinden 36 ug CMV-trifusion Reportergen DNA mit 4,5 ml OPTI-MEM. Flick jedes Rohr zu kombinieren und zu warten, 5 min. Kombinieren Inhalt beider Rohre, vorsichtig mischen und Inkubieren bei Raumtemperatur für genau dreißig Minuten. Hinweis: In einem zweiten Kolben sollten auch für nicht transfizierte Zellen eingestellt werden, dass nur empfangen Lipofectamin und OPTI-MEM, um als Negativkontrolle zu dienen.
- Entfernen Medium von C2C12 Zellen und fügen 15,5ml frisches HG-DMEM/10% FBS-Medium. Fügen Transfektionsmedium zum Gesamtvolumen auf 20 ml zu bringen.
- Erlauben Zellen über Nacht transfizieren für mindestens 20 Stunden bei 37 ° C.
- Am nächsten Tag absaugen Transfektionsmedium und 10 ml HG-DMEM/10% FBS.
- Sehen Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Erfassen sowohl Hellfeld und rote Fluoreszenz Bilder (mit einem TRITC-Filter cube; mRFP ex / em: 584/607 nm). Zähle die Anzahl der RFP-exprimierenden Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop durch die Gesamtzahl der Zellen unter Hellfeld für mehrere Felder der Blick auf die Transfektionseffizienz zu generieren angesehen unterteilt angesehen.
3. Assessment of Cell Survivability / MTT Assay
- Einen Tag vor der Transfektion Platte 1x10 5 C2C12 Zellen in jedem Well in einer 24-Well-Platte. Zellen sollten in 500 ul Volumen in HG-DMEM/10% FBS ausplattiert.
- Am nächsten Tag transfizieren Myoblasten über Nacht wie zuvor beschrieben. Herstellerangaben Vorschläge für die Transfektion Reagent-Volumes für eine 24-Well-Platte. Inkubieren eines Satzes von Vertiefungen mit Lipofectamin durch (keine DNA) als Kontrolle. Sehen Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass ordnungsgemäße Transfektion aufgetreten.
- Entfernen Transfektionsmedium und inkubieren Myoblasten mit 5 mg / ml Thiazolyl Blau tetrazoliumbromid (MTT) in HG-DMEM/10% FBS. Hinzufügen D-Luciferin zu acht der transfizierten Brunnen, und Inkubieren bei 37 ° C für vier Stunden.
- Entfernen Medium aus Brunnen. Solubilisierung blauen Formazan Kristalle durch Zugabe von 180 ul Isopropanol in jede Vertiefung. Schütteln bei 37 ° C für 15 min.
- Vermeidung jeglicher Niederschlag, Pipette Lösung in eine 96-Well-Platte und Extinktion bei 575 nm auf.
4. Herstellung von Myoblasten für Transplant
- Entfernen Medium, waschen Myoblasten mit HBSS und trypsinieren Zellen wie in 1,1 skizziert.
- Resuspendieren Zellen in 4 ml vollständigem Medium.
- Mit einem Hämocytometer zählen Zellen Bände mit 10 6 Myoblasten zu generieren. Pipette volume in sterile 1,5 ml Reaktionsgefäße. Mit einer Transfektionseffizienz von ~ 10%, geben diese Werte dass 100.000 Luciferase-exprimierenden Zellen werden auf der GE ExploreOptix Scanner nach der Transplantation nachweisbar.
- Erreiche endgültigen Injektionsvolumen von 15 ul, mit 10 6 C2C12 Zellen. Wenn nötig, zentrifugieren Mikroröhrchen bei 2.000 rpm für 1 Minute. Vorsichtig absaugen Überstand mit einer Pipette. Resuspendieren Zellen in 15 ul HG-DMEM fehlt FBS.
5. Zellimplantation
- Anesthetize Maus mit 2% Isofluran / 2% O 2. Pluck Haare aus dem dorsalen Hinterbein Bereich. Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5% Isofluran / 2% O 2.
- Stellen Sie sicher, C2C12 Myoblasten sind gut aufgehoben. Mit der Maus in Bauchlage, verlängern die Hinterbein und verwenden Sie eine Insulinspritze, Zellen direkt in den seitlichen Kopf des M. gastrocnemius bei einem Winkel von 30 ° zu injizieren. Injizieren transfizierten Myoblasten in den rechten hinteren Extremität und untransfizierten Myoblasten into die Gegenseite (links) Hinterbein.
- Führen Sie eine Baseline Biolumineszenz-Scan: Schnell zu übertragen Maus auf die Bühne in der optischen Scanner, legen Sie die Maus in Bauchlage. Schließen Sie das Anästhetikum Linie. Um sicherzustellen, dass die Maus weiterhin betäubt, sollte eine zweite Person anwesend sein, um hook up das Anästhetikum Linie, während die anderen Orte das Tier in den Scanner.
- Gently erweitern das Hinterbein so im Bereich der Injektion sichtbar ist. Band Hinterbeine an Ort und Stelle mit einem sanften Klebstoff wie medizinisches Klebeband.
- Schließen der Kammer und sicherzustellen, daß kein Licht in das Innere des Scanners zuzugreifen, da dies das Hintergrundsignal detektiert erhöhen. Der Scanner sollte die Parameter in Ihrem Anweisungen des Herstellers für Biolumineszenz-Bildgebung enthalten eingestellt werden. Insbesondere ist sicherzustellen, "kein Laser" ausgewählt ist.
- Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) um den gezupften Bereich und Scan starten.
6. Die Injektion von Fluc Substrat, D-Luciferin in mdx-Maus
<ol>7. BLI um Luc-exprimierenden MPCs Nach Implant in Mausmodellen der DMD Richten
- Nach Aufnahme Zeit betäuben Maus wieder, wie in 5.1 beschrieben.
- Übertragen der Maus zurück zu dem optischen Scanner und lassen nochmals Biolumineszenz Abtastung in der gleichen Weise wie der Hintergrund-Scan.
- Obwohl ein 20 min Aufnahmeperiode maximale Signalstärke bieten sollte, kann bei einer späteren Untersuchung durchgeführt werden.
- Nach Abschluss der Bildaufnahme, opfern die Maus nach den Richtlinien von Ihrem Institutional Animal Ethics Committee und des Canadian Council on Animal Care (CCAC) eingestellt. Isolieren Hinterbein Muskeln und unmittelbar in 10% Formalin für Paraffin Einbettung beheben. Führen Immunhistochemie Färbung für Luciferase intramuskuläre Injektion von Myoblasten zu bestätigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bei 50-60% Konfluenz, C2C12 Myoblasten wurden vorübergehend mit der oben erwähnte Fusionsprotein Reportergenkonstrukt bestehend aus Glühwürmchen-Luciferase transfiziert [fluc], monomere rot fluoreszierendes Protein [mRFP] und sr39 Thymidinkinase [sr39tk] (Abb. 1A). Die Transfektionseffizienz wurde durch Fluoreszenzmikroskopie (1B, C) berechnet wird, unter Verwendung der in unserer mRFP Sequenz Reporterkonstrukt. Zelle Überlebensfähigkeit wurde nicht durch die Kennzeichnung mit dem BLI Substrat, D-Luciferin (1D) betroffen. Nach der Transfektion wurden ca. 100.000 mRFP-exprimierenden Myoblasten intramuskulär in den Gastrocnemius-Muskel von mdx Mäusen (vorher bestimmt wurden, verifiziert Manuskript) implantiert; 100.000 untransfizierten Zellen wurden in ähnlicher Weise in der kontralateralen Hintergliedmaße als Kontrolle implantiert. Unmittelbar folgenden Zelle Implantation wurden die Mäuse intraperitoneal (IP) mit 150 mg / kg D-luciferin. Nach einer Aufnahmeperiode von ~ 20 min wurden die Mäuse an einem kleinen Tier optischen Scanner (GE ExplorOptix Blackbox für lebendes Tier Biolumineszenz und Fluoreszenz ausgestattet ist) abgebildet wird. Wie zuvor gezeigt, sowohl in vitro als auch nach der Implantation (Manuskript submitted) Aufnahme von D-Luciferin war spezifisch für Schwankungen exprimieren Myoblasten, ohne nachweisbare Biolumineszenz in nicht transfizierten Zellen (Abb. 2). Immunhistochemie bestätigt intramuskuläre Transplantation von Myoblasten (Abbildung 3)
Abbildung 1 Schematische Darstellung des CMV-trifusion Reporterkonstrukt (A);. Hellfeld / Fluoreszenzbilder von C2C12-Myoblasten mit dem trifusion Reporterplasmid (B, C) transfiziert; MTT-Assay zur C2C12 Zellen Überlebensfähigkeit nach Markierung mit BLI Substrat, D-lucifer beurteilen in (D).
Abbildung 2. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Eine Region von Interesse (ROI) gezogen wird, um den Hinterlauf gezupft Bereich, wo Myoblasten injiziert (A) umschließen. Biolumineszenz ist während eines Hintergrund-Scans (B) erfasst wird. Bei 23 min nach der Injektion von D-Luciferin, ist ein klares Signal aus dem rechten Hinterbein, wo Luciferase-exprimierenden Myoblasten injiziert werden erkannt. Kein Biolumineszenz in der kontralateralen Hinterbein mit nichttransfizierten Myoblasten (C) injiziert erkannt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
upload/50119/50119fig3.jpg "/>
Abbildung 3. IHC Verwendung eines Antikörpers bestätigt Glühwürmchenluciferase intramuskuläre Implantation von transfizierten C2C12 Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Studie haben wir eine schnelle und zuverlässige molekulare Bildgebung, Reportergen Ansatz zur nicht-invasiven Ziel Myoblasten / MPCs beschrieben nach der Transplantation. Während diese Studie demonstriert die kurzfristige Lokalisierung von transplantierten MPCs über bioluminescense Bildgebung (BLI), der Art, in der Zellen ausgerichtet sind können in der Tat leicht zu einer longitudinalen Beurteilung Engraftment aufgebracht werden, durch die Implantation von Zellen, die stabil exprimieren das Reportergen. Zu diesem Zweck hat sich unsere Gruppe transgenen Mauslinien, die die einheitliche Reportergen beherbergen generiert. Nur Zellen, die das Reportergen oxidieren D-Luciferin Photonen zur Visualisierung mit BLI produzieren. Da die Oxidation von D-Luciferin ist abhängig von Genexpression, ist dies eine leistungsstarke Technologie, mit denen nicht-invasiv Bild tragfähige transplantierten Zellen. Muskelgewebe aus diesen transgenen Mäusen und Satelliten-Zellen (SCs) über FACS isoliert geerntet kann in der Tat targeted nach der Implantation in mdx-Mäusen. Zusätzlich können wir ihre Differenzierung Status durch die Verwendung einer Muskel-spezifische Promotor verfolgen, ferner Erhöhung des Nutzens und der Bedeutung der molekularen Bildgebung Technologien wie hierin präsentierten auf das Gebiet der Forschung DMD (Manuskript submitted). Neben seiner Schnelligkeit und Low-Cost ist BLI ungiftig, so dass es zu einer attraktiven Wahl für häufige Abbildung von kleinen Tieren. Diese Funktion, sowie seiner hohen Spezifität, werden bei der Verfeinerung Myoblasten-Ersatz-Therapien in präklinischen Krankheitsmodellen der Duchenne-Muskeldystrophie, bevor zum klinisch anwendbar Studien mit Technologien wie PET von unschätzbarem Wert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Sanjiv Gambhir für das Geschenk des fluc/mrfp/sr39tk Reportergen danken. Diese Arbeit wurde von The Stem Cell Network (SCN) von Kanada und des Jesse Journey Foundation finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E.
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, Humana. Totowa, NJ. 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
