¿Cómo las redes neuronales se establecen en el cerebro embrionario es una cuestión fundamental en la neurobiología del desarrollo. Aquí hemos combinado una técnica de electroporación con herramientas genéticas novedosas, tales como Cre / Lox-plásmidos y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada por el cerebro posterior aviar para etiquetar interneuronas dorsal y seguimiento de sus proyecciones axonales y metas sinápticas en las diversas etapas de desarrollo.
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Artículo de método
La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo
En este artículo
Resumen
Resumen
La electroporación del tubo neural de embriones de pollo tiene muchas ventajas tales como ser rápida y eficiente para la expresión de genes extraños en células neuronales. En este manuscrito se proporciona un método que demuestra cómo única para electroporar ADN en el cerebro posterior aviar en E2.75 con el fin de etiquetar específicamente un subconjunto de células progenitoras neuronales, y cómo seguir sus proyecciones axonales y metas sinápticas en una fase mucho más avanzada de desarrollo, hasta E14.5. Hemos utilizado herramientas genéticas nuevas que incluyen elementos específicos potenciadoras, Cre / Lox - plásmidos basados y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada para dirigir la expresión de GFP en un subtipo de células del cerebro posterior (dorsal más subgrupo de interneuronas, DA1). Trayectorias y objetivos de DA1 axonal axones se siguen en las etapas embrionarias tempranas y tardías en varias regiones del tronco cerebral. Esta estrategia contribuye con técnicas avanzadas para atacar a las células de interés en la parte posterior del cerebro embrionario y de tracing formación circuito en múltiples etapas de desarrollo.
Introducción
El cerebro posterior representa un concentrador relé clave del sistema nervioso mediante la comunicación entre los sistemas nerviosos central y periférico por medio de ascendente y descendente redes neuronales. Regula las funciones básicas como la respiración, la conciencia, el oído y la coordinación motora 1-3. Durante el desarrollo embrionario temprano, la parte posterior del cerebro de vertebrados se subdivide transitoriamente a lo largo de su eje antero-posterior (AP) en rhombomeres repetitivas, en las que se forman distintos tipos de células neuronales y generan múltiples centros de los núcleos del tronco cerebral 4. El cerebro posterior ta....
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Protocolo
1. La electroporación Rombencéfalo
1.1 Manejo de Huevos
- Coloque los huevos horizontalmente en un incubador humidificado (37-38.5 ° C). Los embriones son electroporación después de 65-70 horas de incubación, cuando alcanzan 16-17 (HH) etapa (25-30 somitas).
- Eliminar los huevos de la incubadora, sino que permanecen en la posición horizontal.
1.2 Preparativos
- Tire de capilares de vidrio (0,5 mm de diámetro).
- Conectar dobladas en forma de L de oro Genetrodes electrodos (3 mm de diámetro) con un soporte del adaptador para el generador de impulsos. Electroporación parámetr....
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Resultados
Este protocolo fue utilizado recientemente para descubrir los patrones axonal y sitios de proyección de DA1 subgrupo de interneuronas en el cerebro posterior chica 10. Para etiquetar específicamente estos axones, se confirmó un elemento potenciador (Atoh1), que anteriormente ha sido caracterizado como específico para las neuronas espinales ED1 8,12,13, que se expresa en las células del cerebro posterior 10 DA1. El elemento fue clonado aguas arriba de la recombinasa Cre y co-electroporaci.......
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Discusión
En electroporación in ovo es una herramienta viable, fiable y eficaz para examinar especificación de las células y la guía axonal durante el desarrollo del sistema nervioso polluelo 20. En este protocolo se describe un modo de electroporación en el cerebro posterior chica en E2.75 utilizando elementos potenciadores que permiten el etiquetado condicional de interneuronas específicos. Esta estrategia se combina con el sistema de transposición mediada por PiggyBac para insertar genes extraños e.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Yuval Gottlieb-Dror para la ilustración de la electroporación. Este trabajo fue apoyado por becas a DSD de El Instituto Nacional de Psicobiología en Israel y en el programa de cooperación Niedersachsen-Israel Investigación y de subvenciones a AK de la Fundación Ciencias de Israel, el Ministerio de Salud de Israel, y el Centro del Patrimonio Excelencia-Legacy asociación Ciencias Biomédicas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Electrodos Genetrodes de oro en forma de L de 3 mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 | |
| generador de impulsos, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| OCT (Temperatura óptima de corte) | Compound Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Esmalte | |
| de cualquier proveedor comercial |
Referencias
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y.
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Reimpresiones y permisos
