Ex Vivo Blood Red Cell Hemólisis Ensayo para la Evaluación de pH sensibles a agentes endosomolítico para la entrega citosólica de Drogas biomacromoleculares

Resumen

Un ensayo de hemólisis se puede utilizar como una rápida, de alto rendimiento pantalla de cytocompatibility sistemas de administración de fármacos y la actividad endosomolítico para entrega de carga intracelular. El ensayo mide la disrupción de membranas de eritrocitos como una función del pH del medio ambiente.

Resumen

Bicapas de fosfolípidos que constituyen endo-lisosomal vesículas pueden suponer un obstáculo para la entrega de medicamentos biológicos a los objetivos intracelulares. Para superar esta barrera, una serie de portadores de fármacos sintéticos han sido diseñados para interrumpir activamente la membrana endosomal y entregar la carga en el citoplasma. Aquí se describe el ensayo de hemólisis, que se puede utilizar como rápido y de alto rendimiento para la pantalla cytocompatibility y actividad endosomolítico intracelulares de sistemas de suministro de fármacos.

En el ensayo de hemólisis, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares, endosomal temprano y tardío endo-lisosomales entornos. Tras una etapa de centrifugación para sedimentar glóbulos rojos intactos, la cantidad de hemoglobina liberada en el medio se midió espectrofotométricamente (405 nm para el mejor rango dinámico). El porcentaje de glóbulos rojos interrupción se cuantifica en relación con el control positivo samples lisadas con un detergente. En este sistema de modelo de la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. El resultado deseado es la hemólisis despreciable a pH fisiológico (7,4) y la hemólisis robusta en el intervalo de pH endo-lisosomal de aproximadamente pH 5-6.8.

Introducción

Aunque hay muchos potenciales de alto impacto dianas terapéuticas dentro de la célula, la administración intracelular de agentes plantea un desafío significativo. Con frecuencia, los fármacos, especialmente biológicos, son internalizados por las células a la trata en vesículas que o bien conducir a la degradación de su contenido a través de la vía endo-lisosomal, o son transportados de nuevo fuera de la célula a través de exocitosis. ¹ En el último proceso, el pH interno de las vesículas se acidifica a aproximadamente 5-6, que es el pH óptimo para la actividad de las enzimas que funcionan en este compartimiento, tal como lisozima. ²

Recientemente, una serie de materiales han sido diseñados específicamente para aprovechar la acidificación de los endosomas para facilitar la entrega citosólica de su carga. Un ejemplo de este enfoque utiliza polímeros sintéticos, nanopartículas micelares cuyo núcleo es de ion híbrido y neutro de carga a pH fisiológico (es decir, 7,4). Sin embargo, a pH 6,0- 6,5, los polímeros a ser protonados y adquirir una carga positiva neta que desestabiliza el núcleo de la micela, y los segmentos de polímero expuestos interactuar con y alteran la membrana endosomal. Esta actividad se ha demostrado para promover el escape endosomal de péptidos y ácidos nucleicos basados ​​en ácido terapéutica, lo que les permite acceder a sus objetivos citosólicas. ^3,4 Otros ejemplos de métodos desarrollados para mediar de escape endosomal que interrumpir la barrera de la membrana incluyen 'fusogénicos' o péptidos proteínas que pueden mediar la fusión de membranas o la formación de poros transitorios en la bicapa de fosfolípidos. ⁵ homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo tales como poli (ácido propilacrílico) son otro enfoque bien estudiado, y en estos polímeros, el estado de protonación de ácido carboxílico colgantes dicta transición en un hidrófobo, la membrana disruptiva de estado en intervalos de pH endo-lisosomales ^6,7.

Un sistema de modelo útil para el cribado de comportamiento endosomolítico es el correox dependiente del pH in vivo ensayo de hemólisis. ⁸ En este sistema modelo, la membrana de los eritrocitos sirve como un sustituto para la membrana de bicapa lipídica que encierra endo-lisosomales vesículas. Este modelo generalizable ha sido utilizado por otros, para evaluar el comportamiento de endosomolítico penetran en las células péptidos y otros sistemas poliméricos de liberación de genes. ^8-11 En este experimento, las células rojas de la sangre y los materiales de ensayo se incuban conjuntamente en tampones a pH definidos que imitan extracelulares (7,4), a principios endosomal (6,8), y tarde endo-lisosomal (<6,8) entornos. La cantidad de hemoglobina liberada durante el período de incubación se cuantificó como una medida de la lisis de glóbulos rojos, que se normaliza a la cantidad de hemoglobina liberada en muestras de control positivas lisadas con un detergente.

A partir de la detección de una pequeña biblioteca de materiales de ensayo potencialmente endosomolítico, se puede inferir que las muestras que no producen hemólisis a un pH de 7,4, pero dobladillo significativamente elevadosolysis a pH <6,5, serán los candidatos más eficaces y citocompatible para administración de fármacos citosólica. Los materiales que se ajusten a estos criterios se espera que permanezca inerte y no indiscriminadamente destruir las membranas de bicapa lipídica (es decir, que podría causar citotoxicidad) hasta ser expuesto a una caída en el pH local después de la internalización en endo-lisosomales compartimentos.

En este protocolo, los eritrocitos se aíslan de un donante humano y co-incubadas a pH 5,6, 6,2, 6,8, o 7,4 con agentes experimentales endosomolítico de suministro de fármacos. Los eritrocitos intactos se sedimentan, y los sobrenadantes (que contiene la hemoglobina liberada a partir de eritrocitos lisados) se analizan para la absorbancia característica de la hemoglobina a través de un lector de placas (Figura 1).

Protocolo

1. Preparación y Esterilización de tampones y agentes de prueba

1. 150 mM de tampón de NaCl: Disolver 4,383 g de cristales de NaCl en 500 ml de agua nanopura.
2. Tampones de pH: Preparar los tampones de fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, y 7,4 mediante la mezcla de cantidades apropiadas de monobásico y fosfato sódico dibásico. Si las muestras se van a probar a valores de pH más bajos (es decir, pH <5,6) y luego una amortiguación más apropiado, tal como tampón citrato, se debe utilizar. Recetas de búfer están disponibles, y un ejemplo de referencia ha sido proporcionada aquí ^12.
3. Esterilice todos los tampones mencionados anteriormente a través de un aparato de vacío botella-top filtración y vuelva a comprobar el búfer de pH.
4. 20% de Triton X-100 (control positivo): Mezclar 20 ml puro Triton X-100 en 80 ml de agua nanopura. Agitar vigorosamente y sonicado para disolver. Dejar a temperatura ambiente durante la noche antes de su uso.

2. Preparación de eritrocitos

1. Obtener 25 ml de sangre from un donante anónimo humano, dibujado directamente en K _2-EDTA Vacutainer tubos recubiertos para evitar la coagulación.

NOTA: Todos los procedimientos deben ser previamente aprobados por la junta de revisión competente Institucional (IRB) y la punción venosa y la extracción de sangre debe ser realizada por un flebotomista capacitado con el fin de minimizar el riesgo para el donante. Los procedimientos estándar de flebotomía se han publicado en otros lugares ^13.

2. Centrifugar la sangre a 500 xg durante 5 min, y los niveles de marca de hematocrito (rojo, capa inferior) y plasma (capa amarillenta, superior) en el tubo.
3. Aspirar suavemente plasma a través de una pipeta, añadir a lejía, y descartar a los residuos biológicos peligrosos.
4. Llene el tubo hasta la línea marcada hematocrito (nivel original de plasma) con 150 mM de NaCl. Cierre e invierta varias veces para mezclar suavemente. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
5. Repita los pasos 2.3-2.4 para lavar los glóbulos nuevo. A continuación, aspirar supernathormiga y reemplazar con PBS a pH 7,4. Invertir para mezclar.
6. Dividir sangre uniformemente en cuatro tubos, correspondientes a cada pH que se pondrá a prueba. Etiquetar los tubos de acuerdo a cada pH a ensayar (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
7. Centrifugar los tubos de sangre a 500 xg durante 5 min. Marque los niveles en los tubos, y aspirar el sobrenadante.
8. Llenar cada tubo a la línea marcada con tampón de pH apropiado (como se indica en 2,6).
9. Etiqueta cuatro cónico de 50 ml tubos (uno por pH a prueba), y pipeta de 49 ml de PBS de pH apropiado en cada tubo cónico.
10. Añadir 1 ml de eritrocitos (pH misma) en el tubo correspondiente para una dilución 1:50. Inspeccione visualmente la sangre diluida, que debe estar turbio y se asentará si no se toca. Si no se forma de pellets, las células se lisaron.

3. Ensayo de lisis 96 Configuración Plate Bueno y Cuantificación

1. Preparar soluciones madre de todos los agentes de suministro de drogas experimentales, a 20x la concentración final deseada a ensayar (Ensayotendrá 10 l de agente de administración de fármacos + 190 mu l células rojas de la sangre diluida, dando lugar a una dilución de 1/20 de la agente de administración de fármaco original en la mezcla de prueba). Las existencias de 20, 100, y 800 ug / ml, se sugieren, dando lugar a concentraciones de ensayo finales de 1, 5, y 40 mg / ml, respectivamente.
2. Pipetear 10 l de cada solución madre en fondo en V de 96 pocillos. Para obtener resultados óptimos, cargue cada muestra por triplicado o cuadruplicado.

NOTA: Para mayor facilidad, se recomienda que una separada placa de 96 pocillos deben estar preparados para cada pH a ensayar, con cada muestra (a cada concentración) embarcado en n = 3-4 por placa.

3. Para pocillos de control positivo, añadir 10 l de 20% de Triton X-100.
4. Para pocillos de control negativo, añadir 10 l de tampón fosfato. Utilizar una solución tampón al mismo pH para ser probado.
5. Pipetear 190 l de eritrocitos diluidas (ver 2,10) a cada pocillo, haciendo seguro solución stock de celda permanecehomogénea durante la transferencia. Sugerencia: Use una pipeta multicanal para simplificar esta tarea.
6. Incubar las placas a 37 ° C durante una hora (Opcional: Utilice un agitador orbital o basculante).
7. Centrifugar las placas durante 5 minutos a 500 xg para eritrocitos de pellets intactos. Nota: cuando la eliminación de la placa de la centrífuga y su transporte a la siguiente etapa, manipular con cuidado y estar seguro de no perturbar el sedimento celular.
8. Usando una pipeta multicanal, transferir 100 l de sobrenadante de cada pocillo en un claro, de fondo plano de 96 pocillos. Nota: si el sedimento celular se accidentalmente perturbado para cualquier muestra (s), se puede volver a centrifugar la placa y luego proceder con la transferencia de sobrenadante.
9. Medir la absorbancia de los sobrenadantes con un lector de placas. Tenga en cuenta que una gama de longitudes de onda se puede utilizar (400 - 541 nm).

NOTA: Los distintos lectores de placa puede tener diferentes puntos de saturación y la sensibilidad, así que la elección de una longitud de onda para míhicieron mediciones depende de si o no los datos de hemólisis de las muestras experimentales puede ser fiable normalizado contra hemólisis máxima como la inducida por tratamiento con detergente. Esto requiere una medición precisa de los valores de absorbancia de las muestras de control positivas.

10. Uso de Microsoft Excel o un software de análisis de datos similar, hallar el promedio de las lecturas de fondo de absorbancia de las muestras de control negativo establecidos para cada pH (paso 3,4). Restar este valor de la absorbancia de fondo de todas las otras muestras que fueron medidas a ese pH.
11. Después de la sustracción del fondo, encontrar la absorbancia media del control positivo tratados con detergente muestras (paso 3,3). Entonces normalizar todos los puntos de datos experimentales para este valor de absorbancia media, que debería representar el 100% de hemólisis. Por último, multiplica cada valor bien por 100% para calcular el% de hemólisis que se produjo en cada pocillo individual en relación con el control de detergente.

Resultados

Típicamente, los agentes que exhiben ideales dependiente del pH comportamiento hemolítica tienen el mayor potencial para la entrega citosólica de fármacos, ácidos nucleicos, u otras moléculas bioactivas. Esto se ejemplifica por el Agente # 1 como se representa en la figura 2, que muestra la hemólisis mínima a un pH de 7,4, pero un fuerte aumento en el comportamiento hemolítica a intervalos de pH endosomal (<6,5). Algunos agentes pueden mostrar niveles significativos de comportamiento hemolítica...

Discusión

sensibilidad al pH polímeros u otros agentes diseñados para la función endosomolítico puede ser rápida y eficaz detección basado en la lisis de las células rojas de la sangre a valores de pH encontradas en el endosoma (Figura 1; pH 6,8 - endosoma temprano, pH 6,2 - endosoma tardío, pH 5,6 - lisosoma). ^14-17 dependiente del pH hemólisis se ha utilizado para cribar la capacidad de las compañías para mediar en la liberación endosomal de la terapéutica biomacromoleculares (por ejemplo, p...

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
BD Vacutainer - K2EDTA tubos vacutainer	Fisher Scientific	22-253-145	Para la recolección de sangre
BD Vacutainer recolección de sangre, agujas de calibre 20,5	Fisher Scientific	02-665-31	Para la recolección de sangre
BD Vacutainer Tube soporte / adaptador de aguja	Fisher Scientific	22-289-953	Para la recolección de sangre
BD Marca Alcohol isopropílico Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	Para la recolección de sangre
BD Vacutainer sin látex Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Para la recolección de sangre
El ácido clorhídrico (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	Para el ajuste del pH de D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	El control positivo
PBS de Dulbecco	Invitrogen	14190
Nalgene estéril desechable MF75 Bottle-Top Unidad de filtro con membrana SFCA	Fisher Scientific	09 a 740-44A
BD placas de 96 pocillos, de fondo plano, de cultivo de tejidos tratados con poliestireno	Fisher Scientific	08 a 772-2C	Para la placa de lectura al final del ensayo.
BD placas de 96 pocillos, de fondo redondo, de cultivo de tejidos tratados con poliestireno	Fisher Scientific	08-772-17	Para la incubación de las células rojas de la sangre con agentes experimentales.