Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Resumen

Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

Resumen

Placas de Peyer (PP) son componentes integrales de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT) y desempeñan un papel central en la vigilancia inmunológica intestinal y la homeostasis. Antígenos particulados y los microbios en el lumen intestinal son continuamente muestreados por células M del PP en el epitelio del folículo asociado (FAE) y se transporta a una red subyacente de células dendríticas (DCs), macrófagos, y linfocitos. En este artículo, se describen protocolos en la que PP murinos son (i) disociaron en suspensiones de células individuales y se sometieron a citometría de flujo y (ii) preparado para crioseccionamiento y inmunotinción. Para citometría de flujo, los PP son disociaron mecánicamente y después se filtró a través de membranas de 70 micras para generar suspensiones de células individuales libres de células epiteliales y los desechos grandes. Comenzando con 20-25 pps (de cuatro ratones), este método rápido y reproducible permite obtener una población de> 2,5 x 10 ⁶ células con> 90% la viabilidad celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly aislados se sumergen en una temperatura óptima de corte (OCT) medio, snap-congelado en nitrógeno líquido, y luego seccionado utilizando un criomicrotomo. Las secciones de tejido (5-12 micras) se secan al aire, se fijaron con acetona o metanol, y después se somete a inmunomarcaje.

Introducción

Placas de Peyer (PP) son agregados macroscópicos de organizados folículos linfoides presentes en todo el intestino delgado de los seres humanos y ratones (Figura 1) y que constituyen los sitios primarios en el que respuestas inmunes mucosales son iniciadas contra antígenos de la dieta, las bacterias comensales, agentes patógenos, y vacunas orales ^1-4. A diferencia de otros tejidos linfoides periféricos, tales como los ganglios linfáticos mesentéricos, PP carecen de vasos linfáticos aferentes. Como tales, las respuestas inmunes adaptativas en EPA son accionados en respuesta a antígenos derivados de la luz intestinal. La toma de muestras de antígenos luminales se lleva a cabo por el epitelio del folículo-asociado (FAE), que consta tanto de los enterocitos y células de muestreo de antígeno conocidas como células M. Debajo de la FAE, en la cúpula de sub-epitelial (SED) región, se encuentra una red de células dendríticas (DCs), entremezcladas con los macrófagos, células B, y células T CD4 ^{+ 5-9.} En el núcleo de cada follicl linfoide PPe son células dendríticas foliculares (CDF) y una rica en células B del centro germinal central, flanqueado por zonas interfoliculares T rico en células. Muestreo de antígeno por los resultados de PPS en el desarrollo de IgA plasmablasts celulares + B y las células CD4 ⁺ efectoras y de memoria que la semilla de la propia lámina circundante y proporcionar inmunidad contra una amplia variedad de invasores mucosas.

Disección de los eventos inmunológicos complejos asociados con el muestreo de antígeno, la elaboración y presentación de los PP es una tarea de enormes proporciones, considerando que las células PP constituyen sólo una pequeña fracción del total de células linfoides en la mucosa intestinal. Para ayudar en la caracterización in vitro de las células en este medio, se proporciona un protocolo para la preparación total de células de ratón PP para el análisis de citometría de flujo y funcionales, así como un protocolo para la preparación de PP criosecciones para microscopía de inmunofluorescencia y inmunohistología. Nuestro protocolo para el aislamiento, caracterización y inmunotinción de mouse las células del PP no es nueva en sí misma, como lo demuestra el hecho de que hay numerosas referencias datan de hace más de 25 años que citan estas técnicas ^5,6,9-11. Más bien, el protocolo proporciona un aerodinámico (y visual) método para investigadores recogida PPs por primera vez. Las técnicas descritas se domina fácilmente y producir fácilmente grandes cantidades de células con> 90% la viabilidad celular. El protocolo cryosectioning produce secciones en serie altamente reproducibles idealmente adecuados para la tinción de inmunofluorescencia y la imagen confocal. Por otra parte, el protocolo complementa otros dos artículos recientes Jove. El primero, por Fukuda et al, describe el uso de ensayos de ligadura del asa ileal para evaluar la absorción de las bacterias patógenas por células M del PP ^12. La otra, por Geem y colegas, describe el aislamiento y caracterización de las DCs y macrófagos de la mucosa intestinal del ratón, pero excluye explícitamente PPs de su análisis ¹³.

Protocolo

Los animales fueron alojados en virtud convencionales, libres de patógenos específicos condiciones y fueron tratados en el pleno cumplimiento de Cuidado de Animales institucional del Centro Wadsworth y el empleo directrices del Comité (IACUC).

1. Sonda oral

1. (Opcional) Gavage cepa de ratón de elección con el antígeno o los microbios de interés utilizando un G-22 en x1.5. extremo romo alimentación aguja (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volúmenes de entrega no debe superar los 400 l por ratón.

2. Aislamiento de células de PP para Citometría de Flujo

1. Eutanasiar ratones por asfixia de CO _2, según el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC).
2. Limpiar el abdomen con 70% de etanol o betadine antes de la cirugía. Realizar una laparotomía estándar que implica una única (1 cm) incisión utilizando tijeras quirúrgicas de grado a lo largo de la línea media principio sobre 1,5 cm de la base de la caja torácica. Exponer al porcavidad itoneal e identificar el ciego. Corta el intestino delgado terminal en la unión ileal-cecal y retire con cuidado el intestino en su totalidad. Tener cuidado de no extender demasiado el tejido intestinal a medida que se retira de la cavidad peritoneal.
3. Coloque el intestino delgado en una cama de toallas de papel húmedas o Kimwipes. Mojar el intestino delgado suavemente con solución salina para evitar la deshidratación del tejido. Identificar visualmente PPs individuales situados en el lado anti-mesentérico del intestino (Figura 1). Típicamente, un único ratón tiene de 5 a 10 pps visibles que están distribuidas de manera uniforme desde el duodeno (proximal) de íleon (distal). En promedio, los ratones cuatro producirá 23 PP.
4. Uso de curvas tijeras quirúrgicas, PPS individuales suavemente sobre el consumo y los coloca en solución salina equilibrada de Hank enfriada (HBSS). Nota, las tijeras se debe colocar curva hacia arriba justo por encima del PP y luego suavemente aplicada al tejido. Impuestos Especiales únicamente el PP (no surrounding tejido) y la transferencia de HBSS fría.
   Nota: Todas las incubaciones y etapas de centrifugación de este punto en adelante en la Sección 2 se realizó a 4 º C para preservar la viabilidad celular.
5. Transferir PP en 5 ml de medio de disociación del bazo y se incuba durante 15-20 min a 37 ° C mientras vigorosamente con agitación a 250 rpm. Un mayor tiempo de incubación afectará negativamente a la viabilidad celular.
6. Para generar una suspensión de células individuales, los PP en un lugar estéril (esterilizado en autoclave) 70 tamiz de malla de nylon micras celular y la fuerza moler el tejido en la malla utilizando la base de un émbolo de una jeringa de 1 cc. Alternativamente, los PP sándwich entre dos helados estériles portaobjetos de vidrio de microscopio (en autoclave en sobres) y moler suavemente los tejidos con un movimiento de ida y vuelta. Utilizar una pipeta de transferencia estéril para transferir la suspensión de células en un tubo de 5 ml Falcon.
7. Añadir EDTA a una concentración final de 1 mM a la suspensión celular. Incubar en un agitador para5 min a temperatura ambiente.
8. Decantar suspensión celular a través de un segundo filtro de células 70 micras para eliminar cualquier agregado restantes celulares o restos de tejidos. Recoger las células en un tubo de 15 o 50 ml cónico.
9. Células sujeto a centrifugación suave (5 min a 500 xg). Decantar el sobrenadante y resuspender las células en tampón de flujo, que es solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de suero fetal de ternera (FCS).
10. Para determinar el número de células y la viabilidad, se diluye 1:10 en células con azul de tripano y una inspección visual de las células utilizando un microscopio de luz y un hemocitómetro. Alternativamente, un contador de células condesa (Invitrogen) o instrumento similar se puede utilizar para enumerar automáticamente el número de células y la viabilidad.
    A partir de 20-25 PP, este protocolo debe ceder> 2,5 x 10 ⁶ células totales. Esto equivale a ~ 0.8-1.2 × 10 ⁶ células por ratón.

Etiquetado Anticuerpos de las células para citometría de flujo

Dispensar células (10 ⁵ por pocillo) en pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo redondo.

Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg), y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa.

Resuspender las células en tampón de bloqueo Fc e incubar en hielo durante 15 min. Mientras que hay un número de buffers de bloque disponibles comercialmente Fc (por ejemplo de rata anti-ratón CD16/CD32, BD Biosciences), simplemente usamos medio gastado de una rata B de células de hibridoma (ATCC 2.4.G2) que secreta un anticuerpo monoclonal murino IgG ₁ contra Fc gamma receptores para este paso.

Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg) como anteriormente, y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa.

Añadir fluoróforo anticuerpos conjugados directamente a las suspensiones de células a dilución deseada, e incubar en hielo durante 30 min con agitación continua.

Sujeto a la placa de centrifugación suave (5 min a 1.000 xg), y decantarsobrenadante invirtiendo suavemente la placa.

Lavar las células con 100 l de tampón de flujo.

Centrifugar la placa a 1.000 xg durante 5 min, y el sobrenadante se decanta, invirtiendo suavemente la placa.

Resuspender las células 400 l Tampón de fijación, que consiste en 300 l de tampón de flujo y 100 l de 1% de paraformaldehído en tampón PHEM (60 mM TUBOS, HEPES 25 mM, EGTA 10 mM, 4 mM de MgCl ₂ a pH 6).

Células sometidas a citometría de flujo utilizando un FACSCalibur o equivalente. Analizar los resultados utilizando Cell Quest Pro versión de software 5.2.

3. Preparación de criosecciones PP

1. Antes de la recogida de tejidos, añada una temperatura óptima de corte (OCT) compuesto a base de moldes 7x7x5 mm de plástico. También preparar una piscina de nitrógeno líquido (> 750 ml) en un cubo dewar o hielo.
2. La eutanasia del ratón y realizar un laparotamy, como se describió anteriormente. Retire intestino y el lugar en toallas de papel húmedas.
3. Aaislar PPs para cyrosectioning, cortar segmentos de 0,5 cm transversales del intestino delgado que contienen un único PP y transferencia de tejido a una placa de Petri que contiene PBS. Enjuague suavemente el lumen de estos segmentos con PBS para eliminar los desechos fecales no deseado.
4. Coloque los segmentos intestinales tejido verticalmente dentro de moldes de base que contienen octubre Sumergir los moldes en nitrógeno líquido y permitir que el tejido para congelar completamente (1-2 min). El color de la OCT cambia de transparente a blanco cuando el tejido está completamente congelado. . Para un enfriamiento más gradual (por ejemplo, para reducir el agrietamiento de la OCT), sumergir el molde en un baño de isopentano enfriado con vapores de nitrógeno líquido Nota: Utilizar gafas de seguridad apropiadas cuando se trabaja con nitrógeno líquido.
5. Retirar los moldes congelados de base del nitrógeno líquido utilizando fórceps y permitir que el molde se caliente a temperatura ambiente el tiempo suficiente (~ 10-15 segundos) para permitir que los bordes del bloque de octubre a ablandarse. Para eliminar entonces el bloque congelado de octubre deel molde, invierta el molde y presionar suavemente en la parte posterior para expulsar del bloque a un paño limpio 4 x 4 cm pedazo de papel de aluminio. Inmediatamente envolver el tejido en el papel de aluminio y colocarlo en una bolsa espécimen etiquetado se almacenó en nitrógeno líquido o en hielo seco. Alternativamente, la transferencia del tejido en un congelador (<-20 ° C). Usa el tejido dentro de una semana, de lo contrario los bloques se vuelven frágiles con la edad.

Cryosectioning

6. Criosección el tejido utilizando una Leica CM3050S cryomicrotome o equivalente. La temperatura de la cámara en el criostato se debe establecer a -21 ° C.
7. Luchar por secciones que son 12-14 micras de espesor.
8. Recoger secciones en Fisher SuperFrost Plus (o equivalente) portaobjetos de vidrio para microscopio e inspeccionar visualmente usando un microscopio de bajo nivel luminoso de alimentación. Si hay varias secciones se están recogiendo en una diapositiva, asegúrese de que están agrupados para aplicaciones de tinción aguas abajo.
9. Tienda tse desliza a temperatura ambiente en una caja de diapositivas y, a ser posible, para ser utilizados dentro de unos días.

Anticuerpo Etiquetado de criosecciones y análisis de microscopía confocal

10. Sumerja los portaobjetos en acetona (o metanol) en el vaso de tejido teñido o bastidores durante 2 min. Incubación prolongada puede hacer que los tejidos se desprenda de la diapositiva.
11. Transferir diapositivas para tinción frasco nuevo y se lava 3 veces con PBS-T (1X PBS con 0,05% de Tween-20) durante 3 min cada uno.
12. Rodear las secciones con un lápiz hidrofóbico ImmEdge. Esto asegurará que los reactivos y anticuerpos permanecen confinados a esa área durante las incubaciones.
13. Incubar los portaobjetos en tampón de bloqueo (2% de suero de cabra en PBS) durante 30 min a 37 ° C en una cámara humidificada, protegido de la luz.
14. Incubar los portaobjetos con tampón de bloqueo Fc (véase más arriba) durante 10 min a 37 ° C.
15. Dip diapositivas en PBS-T y la zona seca alrededor de las secciones usando Kimwipes o tejido absorbente.Tenga cuidado de no tocar las secciones de tejidos reales.
16. Superposición secciones de tejido con solución de anticuerpo primario y se incuba durante 30 min a 37 ° C en una cámara humidificada. El anticuerpo primario se diluye típicamente en tampón de bloqueo hasta una concentración final de 20 mg / ml. El uso de anticuerpos marcados directamente primarios es deseable, porque tanto como tres anticuerpos se pueden combinar directamente en este paso. Anticuerpos directamente marcados también eliminar la necesidad de pasos adicionales de incubación de anticuerpos.
17. Lavado de los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) por inmersión en PBS.
18. Si los portaobjetos necesarios, incube con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 30 minutos a 37 ° C en una cámara de humedad.
19. Lavado de los portaobjetos 3 veces (5 min cada uno) por inmersión en PBS.
20. Incubar los portaobjetos durante 4 min en 1% de paraformaldehído en tampón de PHEM, como se describió anteriormente.
21. Lavar los portaobjetos con PBS durante 1 min.
22. Área seca alrededor de las secciones usando Kimwipes u otro absorberent tejido. Tenga cuidado de no tocar las secciones de tejidos reales. Con una pipeta o cuentagotas, coloque suavemente una gota de oro Prolongar medio de montaje directamente en la sección. Aplicar un cubreobjetos de vidrio sobre el medio de montaje teniendo cuidado de evitar burbujas. Utilice papel secante para absorber el exceso de medio de montaje.
23. Seal cubreobjetos para portaobjetos de microscopio con esmalte de uñas comercial y dejar secar al aire.
24. Ver diapositivas con una Leica TCS SP5 o un microscopio confocal equivalente.

Resultados

Análisis de citometría de flujo de suspensiones monodispersas de total de células PP revela una clara distinción entre las preparaciones de células buenas y malas. En preparaciones de células buenas relaciones con más del 80% de viabilidad, la gran mayoría de las células demostrar alta dispersión hacia adelante (FSC), un indicador de volumen celular alta, y baja dispersión lateral (SSC), un indicador de granularidad celular baja (Figura 2A). En este experimento, se preparó también intencionalmente una "...

Discusión

En este artículo, hemos proporcionado protocolos paralelos para preparar PP preparaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo y funcional y cryosections para inmunotinción. Ambos métodos son altamente reproducible y fácilmente accesible, siempre un citómetro de flujo y el criostato están disponibles. Para los investigadores por primera vez hay que señalar que, en comparación con el bazo, los rendimientos totales de células de PP son relativamente escasos. Sin embargo, el protocolo esbozamos e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Artículo	Empresa	Cat. #	Comentarios (opcional)
Compuesto octubre	Tissue-Tek	4583
Moldes Base 7x7x5 mm	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus diapositivas	Thermo Scientific	4951
Rite Edge Hoja	Thermo Scientific	4280L
Anti-ratón CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Ratón CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-CD3-FITC ratón	BD Pharmigen	561798
Ratón anti-CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-Ratón CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-CD19 de ratón-PerCP	BioLegend	115531
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo de fenol	Fisher Scientific	14175-079
70 micras filtro de células	BD Falcon	352350
Spleen medio de disociación	Stem Cell Technologies	7915
Suero de cabra	Invitrogen	16210-072
Fc Block	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes obtenido a partir de la línea celular 2.4.G2
Tijera curva	FST	14061-09
Criostato	Leica	3050
FACS Calibur	BD
Condesa contador de células	Invitrogen
Hematoxilina	Richard Allan	7211
Eosina	Richard Allan	71304
Formalina	Starplex Científico	3661
			Tabla 1. Reactivos y el equipo utilizados en este estudio.