La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Resumen

Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.

Resumen

No virales de suministro de genes usando nanopartículas poliméricas se ha convertido en un enfoque atractivo para la terapia génica para tratar enfermedades genéticas y ¹ como una tecnología para la medicina regenerativa ^2. A diferencia de los virus, que tienen problemas de seguridad importantes, las nanopartículas poliméricas se pueden diseñar para ser no tóxico, no inmunogénico, no mutagénico, más fáciles de sintetizar, químicamente versátiles, capaces de llevar a mayor carga de ácido nucleico y biodegradable y / o sensible ambientalmente. Los polímeros catiónicos se auto-ensamblan con ADN cargado negativamente a través de la interacción electrostática para formar complejos del orden de 100 nm que son comúnmente denominadas nanopartículas poliméricas. Ejemplos de biomateriales utilizados para formar nanoescala nanopartículas de suministro de genes policatiónicos incluyen polilisina, polifosfoésteres, poli (amidoaminas) s y polietilenimina (PEI), que es un no-degradable off-the-shelf polímero catiónico comúnmente usado para el suministro de ácido nucleico ^1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) son una nueva clase de polímeros catiónicos ⁴ que son hidrolíticamente degradables ^5,6 y se ha demostrado ser eficaz en la entrega de genes para tipos de células difíciles de transfectar tales como células de la retina humanas endoteliales (HRECs) ^7, las células epiteliales mamarias de ratón ^8, las células humanas de cáncer de cerebro ⁹ y macrovasculares (vena umbilical humana, HUVEC) células endoteliales ^10.

Un nuevo protocolo para caracterizar las nanopartículas poliméricas que utilizan nanopartículas de análisis de seguimiento (NTA) se describe. En este enfoque, tanto la distribución del tamaño de partícula y la distribución del número de plásmidos por partícula se obtienen ^11. Además, una placa de ensayo de alto rendimiento de transfección de 96 pocillos para la detección rápida de la eficacia de la transfección de nanopartículas poliméricas se presenta. En este protocolo, poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) se utilizan como polímeros de modelo y células humanas endoteliales retinianas (HRECs) se utilizan como moDel células humanas. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para evaluar cualquier nanopartícula polimérica y cualquier tipo de célula de interés en un formato de placa de múltiples pocillos.

Introducción

La determinación del número de plásmidos acomplejados por nanopartículas es importante diseñar eficaces estrategias basadas en nanopartículas de suministro de genes, en particular para el cosuministro de los plásmidos múltiples a la misma célula objetivo, como se requiere a menudo en estudios de células madre reprogramación ^12. Algunos enfoques para calcular el número de plásmidos asociados con una nanopartícula solo se han descrito, y cada enfoque tiene inconvenientes en las técnicas utilizadas para la estimación de ^13-16. Puntos cuánticos (QD) etiquetado combinado con TEM se ha utilizado para estimar plásmidos por partícula en nanopartículas a base de quitosano. Estimación con esta técnica QD es complicado debido a la necesidad de etiquetar el ADN, que puede alterar sus propiedades de autoensamblaje, la posibilidad de que el ADN no marcado encapsulado no se detecta directamente; plásmidos potencialmente superpuestos y QDS en las imágenes de TEM 2D de partículas, y otros supuestos simplificadores ^13. Un enfoque alternativo que es unpplicable cuando microdominios ordenados existen en las partículas ha sido utilizado para estudiar el ADN lipopoliamina complejos a través de la crio-microscopía electrónica de transmisión (crio-TEM), dispersión de rayos X, y dispersión de luz dinámica (DLS) ^14,15. Desafortunadamente, los materiales tales como las nanopartículas poliméricas aquí investigados no son aplicables con este método. . En otro estudio, Collins et al usaron un flujo de partículas imagen técnica de análisis para estudiar (Lys) _16-que contiene péptido / ADN complejos, sin embargo, su método sólo se puede evaluar más grandes, partículas de tamaño micrométrico ^16. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo ensayo y flexible para cuantificar el número de plásmidos por nanopartícula ^11.

Protocolo

1. Siembra Celular

1. No permitir que las células crezcan a overconfluency. Usar células tempranas de paso cuando la transfección de células primarias.
2. Veinticuatro horas antes de la transfección, Tripsinizar las células, se cuentan las células usando un hemocitómetro, y se diluye la suspensión celular con los medios para conseguir la densidad celular deseada (células / volumen). Se siembran las células en el tejido claro cultivo tratado con fondo plano de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal y depósito. La densidad seleccionada debe dar 70-80% de confluencia en el día de la transfección. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1, las células se diluyeron a 25 a 50 células / l durante los datos de transfección muestran aquí.

2. La transfección celular

1. La dilución del polímero y las poblaciones de ADN. Descongelar polímero y soluciones de ADN de stock a temperatura ambiente (RT). Dilución de la solución stock de polímero y la solución madre de ADN, por separado en claros placas de 96 pocillos utilizando una pipeta de doce canales, Con el disolvente apropiado a las concentraciones requeridas para obtener el peso de polímero deseado para relaciones en peso de ADN (peso / peso). En este caso, el disolvente elegido es 25 mM de tampón de acetato de sodio (pH = 5,2).
   1. ADN de dilución. Típicamente, el ADN se almacenó a 1 mg / ml se diluye en tampón de acetato sódico a una concentración de 0,03 a 0,06 mg / ml en una clara no-cultivo de tejido tratado con placa de 96 pocillos (un pocillo para una sola formulación). Tabla 2 muestra el ADN típico protocolo de dilución para una única formulación se utiliza para transfectar cuatro pocillos replicados en una placa de 96 pocillos sembradas con células procedentes de la Etapa 1.
   2. Polímero de dilución. El 100 mg / ml de polímero / DMSO solución se diluye en tampón de acetato sódico de acuerdo con la concentración requerida para obtener el polímero deseado en el ADN en peso / peso de relación. El rango de peso / peso de proporciones utilizadas típicamente para la administración de genes con poli (beta-amino-éster) s (PBAEs) es de 20 a 100. Polímeros PBAE se diluye primero a 10 mg / ml, seguido por la dilución protocolo como se muestra en la Tabla 3. Las diluciones de polímero se puede realizar en un claro no de cultivo de tejido tratado con placa de 96 pocillos que coincida con la orientación de la muestra de la placa de dilución de ADN.
2. Formación de nanopartículas. Añadir la solución PBAE a un volumen igual de la solución de ADN plasmídico utilizando una pipeta de doce canales y mezclar vigorosamente. Deje incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la auto-ensamblaje.
3. Nanopartículas de transfección. Después de auto-ensamblaje, 20 nanopartículas mu l por pocillo se añaden gota a gota a medio de cultivo utilizando la pipeta de doce canales. Pocillos replicados se deja sin tratamiento o se transfectan con reactivos disponibles comercialmente como controles. Las células transfectadas se incubaron a 37 ° C durante dos a cuatro horas y luego los pozos se remplazó con medio fresco (100 l / pocillo). La elección del tiempo de incubación dependerá de la línea de células, condiciones de cultivo, y sistema de transfección. La diferencia en la transfeccióneficacia y toxicidad de la célula como resultado de la variación de período de incubación se cuantificó mediante el protocolo de análisis descrito en la Etapa 3.

3. Análisis de la eficiencia de transfección y toxicidad celular

Eficiencia de la transfección se analizó visualmente con un microscopio de fluorescencia y se cuantificó usando un citómetro de flujo cuarenta y ocho horas después de la transfección. Toxicidad celular se analiza visualmente con un microscopio de fluorescencia y se cuantificó usando el CellTiter 96 Aqueous One ensayo de veinticuatro horas después de la transfección.

1. Microscopía de fluorescencia. Visualmente analizar los pocillos para la expresión del gen reportero transfectadas (por ejemplo, EGFP o DsRed) usando el canal de fluorescencia adecuado. Adquisición de imágenes para cada pocillo, la elección de los campos de visión que representan adecuadamente la eficacia de transfección de las formulaciones particulares (Figura 1). Tome nota de cualquier toxicidad celular observado visualmente.
2. Citometría de Flujo.
   1. Usar pipetas multicanal para preparar la placa de 96 pocillos para la citometría de flujo. Lavar con PBS, Tripsinizar con 30 l / pocillo de tripsina / EDTA, neutralizar con 170 l de tampón FACS (PBS + 2% de FBS), pipeta hacia arriba y abajo en cada pocillo, incluyendo alrededor de los bordes, y transferir la totalidad de 200 l de volumen de cada pocillo en los pocillos correspondientes de un fondo redondo o fondo V-96-así placa.
   2. Centrifugar la placa a 130 xg durante 5 min a 4 ° C.
   3. Eliminar los medios de comunicación 170 mu l de cada pocillo y las células pipeta para resuspender evitando burbujas. Para utilizar una viabilidad mancha como yoduro de propidio (PI), añadir 10 l de tampón FACS + PI (50:1 tampón FACS: PI dilución; concentración PI stock 1 mg / ml) a cada pocillo. Coloque inmediatamente en hielo y la cubierta de la luz.
   4. Inicie el citómetro de flujo Accuri C6, el HyperCyt 96 y el apego, y el software HyperView. Utilice el diseño de HyperView y las fichas del Protocolo de elegir el adecuado ptipo de retraso, diseño de placa y otros ajustes tales como movimiento / sip / enjuague / shake tiempo. Para el protocolo anterior, los siguientes parámetros se utilizaron, un primer pre-placa durante un minuto, y un batido de pre-placa durante 30 segundos a 2.400 rpm. Tiempo Sip se fijó durante 15 segundos a 15 rpm, una sonda de enjuague cada pocillo durante 2 seg, y una inter-así agitar cada 12 pozos de 12 segundos a 2.400 rpm. El movimiento de la inter-así es importante para mantener las células dispersas en los medios de comunicación, así como para mejorar la capacidad para procesar los datos mediante la inclusión de pausas programadas entre grupos de pozos (en este caso 12 sec).
   5. La pestaña HyperView identificación Bueno para procesar los datos y se separan en el pozo correspondiente (Figura 2). Con el fin de identificar los pocillos individuales, puede ayudar a utilizar el software de filtro de ruido, así como incluyendo una base de filtro, incluso bajo la configuración avanzada.
   6. Cuantificar el porcentaje de células transfectadas positivamente en vivo por gating conveniente separar pop diferenteulations (Figura 3). Primero ver los datos de flujo de un diagrama de dispersión de FSC frente a SSC a fin de separar las células del desechos (Figura 3A). Si yoduro de propidio (PI) se utilizó, puerta la población de células individuales y la vista que los datos sobre una parcela de FSC frente a FL3 a fin de separar las células vivas de las células muertas y la puerta de las células vivas. Con el fin de cuantificar el número de células transfectadas, ver la población de células vivas en los canales apropiados, por ejemplo, GFP puede ser visto en FL1. Uso de la población no tratada, puerta de las células no tratadas con el fin de identificar la señal de fondo (Figura 3B). Las células transfectadas positivamente a continuación, se puede aislar utilizando esta puerta y mediante la visualización de las poblaciones transfectadas utilizando tanto la dispersión y gráficos de contorno (Figura 3C y 3D). Puede haber un continuo de células transfectadas positivamente, como diferentes células se transfectaron con diferentes grados de fluorescencia.
3. CellTiter 96 Aqueous One ensayo
   1. Transfectar otra placa exactamente de la misma manera que para las mediciones de toxicidad celular.
   2. Premezcla 1 ml de la solución acuosa CellTiter 96 Un ensayo con 10 ml de medio fresco. Retire el medio de las células y utilizar una pipeta multicanal para añadir 110 l de la solución premezclada + medios de comunicación por pocillo.
   3. Medir la absorbancia a 490 nm cada intervalo de una hora de 1 a 4 horas hasta que la absorbancia del pozo con la condición sin tratamiento está en el intervalo lineal del ensayo. Incluye cuatro pozos de control con medios de sólo + Solución para una lectura de absorbancia de fondo.
   4. Los valores promedio de la absorbancia de los cuatro pocillos por duplicado por condición y restar la absorbancia media de fondo de cada medio. Normalizar la media corregida para cada condición tratada con la media corregida de la condición no tratada para determinar la viabilidad celular por ciento.

_title "> 4. nanopartículas acerca de tallas con NTA y plásmido Cálculos partículas por

1. Primer sistema de la fluídica de la NS500 NanoSight mediante la ejecución de la bomba de diluyente hacia adelante a aproximadamente 1/5o la velocidad máxima y la bomba de muestra hacia atrás a aproximadamente 1/10th la velocidad máxima. Continúe hasta que el sistema de fluidos se limpia con diluyente.
2. Preparar las nanopartículas para ser analizados. En el caso de PBAEs, separado diluir el ADN plásmido de archivo (1 mg / ml) y almacenadas PBAE (100 mg / ml) en tampón de acetato sódico (25 mM, pH 5) en tubos Eppendorf.
3. Diluir la concentración de ADN de plásmido a 0,06 mg / ml. La concentración de polímero puede variar dependiendo de la requerida peso-peso de polímero de ADN (por ejemplo, para 60 peso / peso de las partículas de polímero se diluye a 3,6 mg / ml).
4. Añadir la solución de polímero a un volumen igual de la solución de ADN plasmídico y mezclar vigorosamente. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la auto-ensamblaje.
5. Dilaúd la disolución de nanopartículas 100 veces en PBS para que la concentración de nanopartículas para estar en el rango apropiado para NTA y para obtener un volumen final de al menos 500 l.
6. Cargar la muestra en el NanoSight colocando el tubo de carga en la muestra de tubo de Eppendorf (Figura 4A). Asegúrese de no introducir burbujas de aire.
7. En el modo de captura, aumente el nivel de la cámara hasta que las partículas se pueden ver. Ajuste el enfoque de modo que las partículas de aspecto liso (Figura 4A y 4B).
8. Mientras que en el modo normal, ajustar el nivel de la cámara pasado el punto de que todas las partículas se pueden ver en pantalla. Entonces, disminuir el nivel de la cámara al nivel más bajo de tal manera que las partículas pueden todo todavía ser observado. Si el nivel de la cámara intermedia que se necesita, entre en el modo avanzado y modificar el obturador de la cámara y obtener los niveles adecuados.
9. Revise visualmente para asegurarse de que son entre 20 - 100 partículas en el screen el. Un número ideal para el seguimiento de las nanopartículas es de aproximadamente 50 partículas. Si hay demasiados o muy pocos, enjuague el NS500, ajustar la dilución en PBS, y volver a cargar la muestra.
10. Ajustar la duración de captura de acuerdo con el modo normal. Típicamente de 30 - 60 segundos es una longitud de captura adecuada (Figura 4B).
11. Para cargar la siguiente muestra, enjuague el sistema y vuelva a cargar la nueva muestra.
12. Una vez que se capturan vídeos, pase a la etapa de procesamiento mediante la apertura de un archivo de vídeo.
13. Hay una serie de parámetros que se pueden sintonizar con el fin de procesar mejor un vídeo (Figura 4C). El objetivo es seleccionar los parámetros que mejor captura de cada partícula en la pantalla, como se indica por una marca de cruz roja en la pantalla sobre cada partícula (Figura 5).
14. Aumentar la ganancia de la pantalla para ver mejor las partículas. En el modo estándar o avanzada, seleccione el ajuste automático de los parámetros pinchandog las casillas correspondientes. En el caso de que la configuración automática no seleccionar adecuadamente las partículas, desactive la casilla y establecer manualmente los parámetros (Figura 4C).
15. Una vez que todas las partículas son recogidas en pantalla, haga clic en el botón de proceso del software para procesar el archivo de vídeo (Figura 4C). Esto proporciona la distribución del tamaño de partícula, promedio del tamaño, así como la concentración de partículas.
16. Con el fin de asegurarse de que la concentración de partículas es preciso, cambiar la dilución PBS, tales como mediante el aumento de la dilución por 2x, y repetir el procedimiento anterior. Medición de múltiples diluciones de la misma muestra se recomienda para asegurar que la medición de la concentración de la muestra es correcta. Un intervalo aceptable para una medición es 10 ⁷ -10 ⁹ partículas / ml.
17. Verificar que todos los plásmidos se incorporan en nanopartículas mediante la ejecución de la electroforesis en gel de las nanopartículas y la evaluación de si cualquier ADN libre presente.Si no todos los plásmidos se encapsulan, usar técnicas estándar para medir la absorbancia de ADN con el fin de cuantificar el total plásmidos encapsulados.
18. Para calcular el número medio de plásmidos por partícula, dividir la concentración total de plásmido encapsulado por la concentración de partículas NTA medido. Con el fin de estimar el plásmido distribución de partículas por muestra, utilizar la primera partícula NTA histograma tamaño para calcular la fracción de volumen de cada bin 1-nm de partícula. Multiplicar esta distribución fracción de volumen por la cantidad de plásmido total para obtener el número de plásmidos en cada bin. Divida estos números por el número de partículas en cada intervalo para obtener el número de plásmidos-per-partículas para cada tamaño de partícula (Figura 6).

Resultados

La Figura 1 muestra una imagen de microscopía de fluorescencia de una muestra de una transfección con éxito de HRECs con el plásmido EGFP. La imagen de campo claro es útil para asegurar que las células mantienen su morfología habitual. Adicionalmente, ensayos de viabilidad celular, tales como MTS o ensayos similares, se puede utilizar para evaluar la toxicidad de las nanopartículas ^7. La citometría de flujo, como se ha descrito, se puede utilizar para cuantificar la eficiencia de la transfecc...

Discusión

Los protocolos anteriores describen métodos para evaluar la eficacia de la transfección de las formulaciones de nanopartículas, así como una forma de caracterizar el tamaño de partícula y carga de ADN de las nanopartículas. El número de plásmidos por partícula es un parámetro importante que puede ayudar a predecir la eficacia de la partícula y también se puede utilizar para la determinación de la dosis. Nanopartículas de análisis de seguimiento se puede realizar en una variedad de diferentes soluciones acuosas, tales co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			Reactivo
Tampón fosfato salino, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Tripsina	Invitrogen	25300
Tampón de acetato sódico	Sigma-Aldrich	S7899	Diluir a 25 mM en agua desionizada
Sulfóxido de dimetilo	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP ADN	Elim biofarmacéuticos	NA
ADN DsRed	Addgene	21718
PEI, ramificado	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 Aqueous One	Promega	G3580
			Materiales
Borrar fondo plano de 96 pocillos, estériles	Sarstedt	82.1581.001
Borrar fondo redondo de 96 pocillos, estériles	Sarstedt	82.1582.001
12-canales Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 y 50-300 l
Microscopio de Fluorescencia	Zeiss	NA	Número de modelo: AX10
C6 Accuri citómetro de flujo	BD Biosciences	NA
HyperCyt adjunto	Intellicyt	NA
NS500	NanoSight	NA