Artículo de método

La electroporación neonatal zona subventricular

DOI:

10.3791/50197

⸱

11 de febrero de 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se demuestra una técnica mínimamente invasiva conocida como electroporación neonatal zona subventricular. La técnica consiste en la inyección de ADN de plásmido en los ventrículos laterales de cachorros neonatales y la aplicación de corriente eléctrica para suministrar y manipular genéticamente las células madre neuronales

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre neurales (NSC) de la línea de los ventrículos laterales postnatales y dan lugar a múltiples tipos de células que incluyen neuronas, astrocitos y células ependimarias 1. La comprensión de los mecanismos moleculares responsables de la NSC auto-renovación, el compromiso y la diferenciación es fundamental para el aprovechamiento de su potencial único para reparar el cerebro y entender mejor los trastornos del sistema nervioso central. Los métodos anteriores para la manipulación de los sistemas de mamíferos requiere el esfuerzo largo y costoso de la ingeniería genética a nivel animal entero 2. Por lo tanto, la gran mayoría de los estudios han examinado las funciones de las moléculas NSC in vitro o en los invertebrados.

Aquí se demuestra la técnica simple y rápida para manipular NPCs neonatales que se conoce como zona neonatal subventricular (SVZ) electroporación. Técnicas similares se han desarrollado hace una década para estudiar NSCs embrionarias y han ayudado a los estudios sobre Cortical desarrollo 3,4. Más recientemente, este fue utilizado para estudiar el cerebro anterior roedor postnatal 5-7. Esta técnica da como resultado el etiquetado robusto de SVZ NSCs y su progenie. Por lo tanto, postnatal SVZ electroporación ofrece una alternativa costo y tiempo efectivo de mamíferos ingeniería genética NSC.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este procedimiento es conforme con los requisitos de Yale IACUC. Los científicos deberían asegurarse de que las directrices sean aprobadas IACUC y siguió de acuerdo a sus necesidades institucionales.

1. Sección 1. Preparación de ADN Pipettes, soluciones y Vidrio

  1. Generar alta pureza (OD 260/280> 1,80) alta concentración (mg / l> 2,5) libre de endotoxinas ADN.
  2. Preparar 0,9% de solución salina y el filtro estéril a través de un filtro de 22 micras.
  3. Colocar 10 cm fuego pulido tubos capilares de vidrio de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) en un modelo PP-830 Narishige PC-10 extractor de pipeta de vidrio con un alambre de Kanthal. Conjunto extractor para una tracción paso ponderado en 70.5 ° C. Rompa las puntas con unas pinzas circulares e inspeccionar bajo un microscopio de disección para los bordes dentados. Puntas cónicas y se coloca bajo una lámpara UV durante 15 min. Pipetas Pulled deben ser marcadas en 2 mm del borde de la punta.
  4. Preparar 0,1% peso / volumen verde rápido solutipor mezcla filtrada estéril solución salina al 0,9% con el verde de secado rápido.

2. Sección 2. Preparación de los animales, pipeta de vidrio de carga y de inyección de plásmido

  1. Retire el día postnatal 0-1 crías en jaulas individuales, en lugar de un plato de Petri de vidrio previamente enfriado a 4 ° C, y luego colocar en hielo húmedo.
  2. Después de aproximadamente 5 min, determinar el estado de anestesia mediante la utilización de la respuesta pellizco pie. Si no hay movimiento, las crías sometidas a la inyección intraventricular.
  3. Es importante señalar que la combinación de verde rápido, ADN, y la solución salina puede dar como resultado la rápida evaporación, cristalización, y el bloqueo de pipetas de vidrio. Por lo tanto, generar una solución madre y parte alícuota de 1-2 l sobre Parafilm inmediatamente antes de las inyecciones.
  4. Aspirar todo el volumen alícuota con la pipeta de vidrio tirado.
  5. Sostenga la cabeza del cachorro entre el pulgar y el dedo índice de su mano menos dominante.
  6. Encienda una lámparad sostenga la cabeza del cachorro a las afueras del haz de luz. Si es necesario, poner en solución salina cabeza para reducir la cantidad de luz reflejada por las crías. Los ventrículos ahora debe estar iluminado.
  7. Con la mano dominante, inserte la aguja en el ventrículo lateral más cercano a usted (Figura 1A y 1B). El sitio de inyección debe ser de aproximadamente equidistante de esta sutura y el ojo y 2 mm lateral a la sutura sagital. Insertar sacó la pipeta hasta la marca de 2 mm para un cachorro P0, que debería asegurar la penetración en el ventrículo lateral. Coincidentemente, es posible que vea el relleno de líquido cefalorraquídeo en la pipeta de la liberación de la presión intracraneal. Para reducir la presión intracraneal, lo que ayuda a la inyección de plásmido, aflojar su control sobre la cabeza de la pup.Step 2,8. Inyectar aproximadamente 0,5 l de plásmido en el ventrículo lateral utilizando un inyector de aire a presión (Picospritzer, Parker).

3. Sección 3. La electroporación y la recuperación

  1. Set la tensión del generador de electroporación para 5 impulsos cuadrados, 50 mseg / pulso a 100 voltios, con intervalos de 950 mseg. La especificidad espacial de la electroporación del plásmido está dictada por la direccionalidad de transferencia de carga. Debe prestarse atención dada a la colocación dada la heterogeneidad de las poblaciones de células madre a lo largo de la SVZ 8. Las diferencias en las tasas de proliferación y el destino celular se han identificado lugares ventral-dorsal y caudal rostral-9,10.
  2. Una vez que el plásmido se inyecta, introducir los electrodos de pinza en PBS. Este paso es maximizar la transferencia de carga y para evitar quemaduras causadas por la resistividad.
  3. Coloque el electrodo positivo en la pared lateral dorsal del cachorro cerca de la oreja ipsilateral al sitio de la inyección de plásmido (Figura 1C y 1D). Coloque el electrodo negativo en el hemisferio contralateral lateral ventral al cachorro hocico.
  4. Iniciar la transferencia actual presionando los foots pulsobruja pedal y barrer los electrodos de dorsal a lateral utilizando ~ 25 ° intervalos angulares.
  5. Lugar a electroporación cachorros en una almohadilla de calentamiento durante 5 min. Gire suavemente crías cada 30 segundos con una estimulación suave.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neonatales subventricular resultados zona de electroporación en el etiquetado de casi toda la glía radial contigua a la zona dorsal, lateral dorsal subventricular, y lateral siguiendo el "barrido" de movimiento del electrodo de pinza (Figura 1E). Sin embargo, la electroporación se pueden adaptar a los requisitos del experimento respectivo pero no barriendo el electrodo y el uso de la colocación y orientación específicos tal como se detalla en el vídeo. Por ejemplo, desde la glía radial dorsalmente local...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí detalle la técnica de electroporación SVZ neonatal, una técnica para etiquetar rápidamente y con firmeza y manipular células SVZ madre y su progenie. Hay varias ventajas que la electroporación tiene en comparación con otras técnicas. En primer lugar, dado el etiquetado focal de células, uno es capaz de discernir celulares autónomos efectos autónomos y no por células. Segunda manipulación, genética utilizando sistemas inducibles permite comparar los efectos antes o después de la integración sináptica. Además, se pue...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Departamento de Defensa (Premio Idea desarrollo, W81XWH-10-1-0041, AB), CT con células madre subvención (AB), y el Instituto Nacional de Salud NRSA 10668225 (DMF). El presente material está basado en trabajo apoyado en parte por el Estado de Connecticut bajo el Stem Cell Research Connecticut Programa de Subvenciones. Su contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Estado de Connecticut, el Departamento de Salud Pública del Estado de Connecticut o innovaciones CT, Inc. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, recogida de datos y el análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Pesado tubo de borosilicato pulido Sutter Instrument BF150-110-10
Dual-Stage vidrio Micropipetas Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Generador de impulsos de onda cuadrada Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fibra óptica Fuente de luz Fisher Scientific 12-562-36
Tungsteno Halógenolámpara USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instrumentos 052-0312-900

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883(2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517(2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13(2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380(2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Neonatal SVZ ElectroporationNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

Artículos relacionados