Cromosoma Preparación de las células cultivadas

Resumen

Los cromosomas se pueden aislar de las células vivas, tales como linfocitos o fibroblastos de la piel, y a partir de organismos, incluyendo seres humanos o ratones. Estas preparaciones cromosómicas se pueden utilizar más de rutina bandeo G y procedimientos citogenéticos moleculares como la hibridación fluorescente in situ (FISH), la hibridación genómica comparada (CGH) y cariotipo espectral (SKY).

Resumen

Cromosoma (citogenética) análisis se utiliza ampliamente para la detección de la inestabilidad cromosómica. Cuando se sigue por bandeo G y las técnicas moleculares como la hibridación in situ fluorescente (FISH), este ensayo tiene la extraordinaria capacidad de analizar las células individuales de las aberraciones que implican ganancias o pérdidas de partes del genoma y reordenamientos que afecte a uno o más cromosomas. En los seres humanos, las anomalías cromosómicas ocurren en aproximadamente 1 de cada 160 nacidos vivos ^{a 1,2,} el 60-80% de todos los abortos involuntarios ^3,4, 10% de los mortinatos ^2,5, 13% de los individuos con enfermedad cardíaca congénita ^6, 3-6% de los casos de infertilidad ^2, y en muchos pacientes con retraso en el desarrollo y defectos de nacimiento ^7. El análisis citogenético de malignidad se utiliza de forma rutinaria por los investigadores y los clínicos, ya que se ha demostrado que las observaciones de anomalías cromosómicas clonales tener tanto significado diagnóstico y pronóstico ^8,9.60, el aislamiento del cromosoma tiene un valor incalculable para la terapia génica y la investigación con células madre de organismos incluyendo primates no humanos y roedores ^10-13.

Los cromosomas se pueden aislar a partir de células de tejidos vivos, incluyendo linfocitos de sangre, fibroblastos de la piel, amniocitos, placenta, médula ósea, y las muestras de tumor. Los cromosomas son analizados en la etapa de metafase de la mitosis, cuando más se condensan y por lo tanto más claramente visible. El primer paso de la técnica cromosoma aislamiento implica la interrupción de las fibras del huso por incubación con Colcemid, para evitar que las células de proceder a la etapa de la anafase posterior. Las células se trataron luego con una solución hipotónica y se conservan en su estado hinchado con fijador de Carnoy. Las células son luego caer sobre portaobjetos y luego se pueden utilizar para una variedad de procedimientos. Bandeo G consiste en el tratamiento de tripsina seguido de tinción con Giemsa para crear la luz característica y bandas oscuras. Lo mismo procedure para aislar cromosomas se puede utilizar para la preparación de células para los procedimientos tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH), y cariotipo espectral (SKY) ^14,15.

Introducción

El análisis cromosómico es una técnica convencional utilizada en todo el mundo para el diagnóstico de la inestabilidad cromosómica y reordenamientos que conducen a trastornos genéticos y ^1,2,8,9 malignidad. Además, una resolución más alta para el diagnóstico y la investigación de anomalías genéticas constitucionales y el cáncer adquirida se puede lograr con la combinación de los procedimientos citogenéticos clásicos y metodologías de citogenética molecular, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH), hibridación genómica comparativa (CGH) y cariotipo espectral (SKY) ^14,15. Más recientemente, estas técnicas se han utilizado para ....

Protocolo

1. Cromosoma La recolección de células adherentes

1. Protocolo Estándar
   1. Se cultivan las células de acuerdo a condiciones específicas de cultivo celular. Cuando las células han alcanzado la fase logarítmica (80% de confluencia), añadir 10 l / ml de Colcemid al matraz de cultivo de células. Se recomienda un mínimo de 2 x 10 ⁶ células.
   2. Se incuban las células a 37 º C en un incubador de _CO2 al 5% durante 45 min. Usando una pipeta estéril, transferir los medios de las células en un tubo cónico de 15 ml. Ponga a un lado.
   3. Lave suavemente las células mediante la adición de 2 ml de HBSS Buffer en el m....

Resultados

Metafase para untar de alta calidad son esenciales para el análisis cromosómico. Un ensayo exitoso produce cromosomas que están bien repartidas y de la morfología cromosómica adecuada. Cromosomas correctamente bandas-G contienen la luz característica y los patrones de bandas oscuras.

Figura 1. Una ex.......

Discusión

Hemos utilizado el presente procedimiento para el cromosoma aislamiento a partir de células de diversos organismos, incluyendo diversos tipos de células obtenidos a partir de humano, macacos Rhesus, ratas, y ratones ^11,20-22. Se proporciona el protocolo estándar, pero ciertos pasos clave y variables puede ser necesario ajustar para estos diversos tipos de células. Varios pasos específicos son cruciales tanto en la preparación cromosómica y bandas G para asegurar la mejor calidad posible de los resultados. Una.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Tampón	Gibco	24020-117
0.5% Tripsina EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Tabletas tampón "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrífuga 5810	Eppendorf
Metanol	Caledon Productos químicos de laboratorio	6700130
ácido acético glacial	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05