Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica Ex utero Electroporación, la disección y la cultura de la totalidad de los hemisferios cerebrales del ratón embrionario. La preparación facilita los estudios farmacológicos y ensayos de la función de genes durante el desarrollo cortical temprano.
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Artículo de método
Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana
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Resumen
Resumen
Desarrollo cortical implica interacciones complejas entre las neuronas y no neuronales elementos incluyendo células precursoras, los vasos sanguíneos, las meninges y la matriz extracelular asociada. Debido a que proporcionan un entorno adecuado organotípico, los explantes corticales rebanada se utilizan a menudo para investigar las interacciones que controlan la diferenciación neuronal y el desarrollo. Aunque es beneficioso, el modelo de explante rebanada puede sufrir de inconvenientes que incluyen la laminación celular aberrante y la migración. Aquí mostramos un todo sistema cerebral explante hemisferio para estudios de desarrollo temprano cortical que es más fácil de preparar que las rebanadas corticales y programas de migración coherente organotípico y laminación. En este modelo de sistema, laminación principios y patrones de migración continuará normalmente durante un período de dos días in vitro, incluido el período de dividir la presiembra, durante el cual la capa cortical prospectivo seis formas. Desarrollamos entonces un ex electroporación in utero (EUEP)enfoque que logra el éxito ~ 80% en la selección de buenas prácticas agrarias expresión en las neuronas en desarrollo en la corteza medial dorsal.
El modelo de explante hemisferio entero hace que el desarrollo temprano cortical accesible para la electroporación, la intervención farmacológica y enfoques en vivo de imágenes. Este método evita la cirugía supervivencia requeridos en el útero de la electroporación (IUEP) enfoques al tiempo que mejora tanto la transfección y la consistencia de área de focalización. Este método facilitará los estudios experimentales de la proliferación neuronal migración y diferenciación.
Introducción
Las formas de la corteza cerebral de mamíferos a través de la proliferación concertada migración y diferenciación de las neuronas generadas sucesivamente. Cada neurona nace en la zona ventricular (VZ) y migra desde el VZ en la zona intermedia (IZ), formando la placa cortical (CP) 1. A medida que pasan a través de diferentes dominios corticales, las neuronas que migran mostrar múltiples modos de migración 2,3 que dependen del ambiente extracelular y otros elementos celulares (por ejemplo, la glía radial) dentro del tejido en desarrollo. Las neuronas corticales entonces detener la migración en la parte superior de la placa de conformación cortical en los procesos coincidentes de detención migración neuronal y 4 dendritogenesis.
Desarrollo cortical se inicia entre días embrionarias 11-13 (E11-13) 5 mediante el establecimiento de la capa plexiforme primordial 6 o la presiembra (PP), una capa de neuronas pioneras que recubre el VZ. FuturoCapa 6 neuronas corticales (es decir, las neuronas corticales primero nacido en el VZ) y luego orientar su Somata en un patrón estereotipado y se unen en una capa distinta en el PP 7. Estos eventos dividir la presiembra en un superficial marginal (futura capa cortical 1) y una zona profunda, el segundo compuesto de células subplaca (capa cortical transitoria 7). Este proceso, denominado fraccionamiento presiembra, es un acontecimiento fundamental en el crecimiento futuro de la corteza cerebral 8.
Muchas mutaciones genéticas se han identificado que interrumpir diversos aspectos del desarrollo cortical 9. Desarrollo cortical también pueden sufrir efectos negativos por la exposición a las toxinas ingeridas como la cocaína y el alcohol 10 11. Debido a las malformaciones corticales que surgen durante el desarrollo probablemente contribuyen a los trastornos neurológicos (por ejemplo, el autismo, la esquizofrenia), las investigaciones empíricas de las perturbaciones del desarrollo cortical son inherentesmente importante. Por tanto, es de gran importancia para establecer enfoques para estudiar el desarrollo cortical que permiten ensayos rápidos de los efectos genéticos o toxina, pero que también preservar las posibles interacciones entre las neuronas diferenciadoras, otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) durante este período temprano del desarrollo del cerebro 12 .
Explantes rebanada 13 han proporcionado un sistema y han sido ampliamente utilizados para el desarrollo del ensayo neurona cortical 14-16. Sin embargo, los ensayos de rebanada puede adolecen del inconveniente de que la migración neuronal y la laminación puede ser anormal 17 posiblemente debido al daño a las células de las meninges que rodean el cerebro en desarrollo y el anclaje radial glial andamiaje. Como las fibras gliales radiales son un importante sustrato para la migración cortical neuronal 18 disrupción de la membrana basal por corte local puede alterar la arquitectura glial radial y causar la migración cortical alterada. Además el sliced superficies de explantes proporciona una región de células muertas que pueden alterar la composición normal de la ECM en estas áreas.
Los enfoques más recientes se han centrado su análisis en células localizadas profundamente en el sector que están rodeados de apropiados tipos de células sanas y ECM. Sin embargo, en algunos casos, estos nuevos enfoques pueden exigir que el original rebanada gruesa cultivadas ser crio-seccionado o seccionado en parafina después de la fijación de manera que el interior relativamente normal de la rebanada está disponible para el análisis 19-21. Tanto el vibratome original de seccionamiento para preparar las rodajas en vivo para el cultivo, así como la posterior de las rebanadas cryosectioning fijos para el análisis requieren un cuidado y esfuerzo para estos ensayos a trabajar.
Proporcionar un enfoque simple y complementaria para los estudios del desarrollo cortical temprano, hemos modificado una rebanada enfoques existentes 13 para facilitar los estudios del desarrollo cortical temprano. Hemos desarrollado un whhemisferio ole explante similar a un modelo existente E14 hemisferio que participan cultivos con agitación a 65 revoluciones por minuto y el crecimiento organotípico permitido para 16-18 horas 22,23 modelo. En nuestro enfoque, los explantes enteros hemisferio se colocan en la membrana semipermeable 13 con en una atmósfera de oxígeno alta cultura 21,24 para extender el crecimiento cortical organotípicos durante 48 horas. Este enfoque también permite la electroporación coherente de desarrollo de las neuronas corticales. Los embriones se extrae del útero y electroporación para introducir ADN plásmido y el telencéfalo es diseccionado a continuación. Cada hemisferio se aísla y se colocan lado medial hacia abajo sobre un filtro revestido con colágeno. El explante se cultivan entonces durante un período de 48 horas, un periodo que abarca dividir la presiembra 8. Durante el período de cultivo, L6 neuronas se desarrollan a partir de precursor a diferenciarse neurona 25, en posición correcta dentro de la placa cortical. A lo largo de este período, el desarrolloneurona está rodeado por el ECM apropiada y tipos de células que se enfrentaría la celda correspondiente en vivo. Este sistema ya ha demostrado su valía en el desciframiento de los eventos celulares que subyacen a la toxicidad del etanol 26, capa 6 y formación presiembra división 7,25.
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Protocolo
1. Electroporaciones Ex utero con Expression proteína verde fluorescente plásmido
- Plásmido de ADN soluciones de inyección se preparan con CAG-eGFP ADN 27 diluido a la concentración de trabajo final de 0,33 mg / ml en ddH 2 O. Qiagen Endo-gratis-Maxi Preps se utilizan para purificar el plásmido a partir de bacterias transformadas. Colorante verde rápido en ~ 0,02% (w / v final) se añade a la solución de ADN como un trazador de inyección.
- Para preparar el área quirúrgica, rocíe mesa de trabajo y la etapa microscopio de disección con una solución de etanol al 70% y secar. Rocíe tijeras y pinzas quirúrgicas, con 70% de etanol antes de la disección y seque.
- Temporizadas embarazadas suizos / Webster presas son sacrificados en E13 por transferencia a una cámara llena de CO 2 de un cilindro presurizado y la presa se monitorea hasta que todo movimiento haya cesado por lo menos durante 1 min. Después del sacrificio por inhalación de CO 2, los embriones se extrae del útero y se colocó enuna placa de Petri de 10 cm de hielo frío que contiene solución salina equilibrada de Hanks (HBSS).
- Diseccionar cuidadosamente cada embrión a partir de las membranas que rodean extraembryonic y mantenerse en hielo-frío HBSS.
- Transferir cada embrión individual a un segundo 10 cm placa de Petri que contiene HBSS fría. Usar una jeringa de Hamilton para inyectar 2-3 l de la mezcla de ADN verde rápido en el ventrículo del hemisferio cerebral izquierdo, teniendo cuidado de inyectar en una zona cortical espacialmente separada de la zona cortical para el análisis futuro.
- Para electroporar, mantenga el embrión suavemente con fórceps y ligeramente colocar la pala del electrodo positivo pinza en la línea media dorsal de la cabeza y colocar suavemente la pala negativo debajo de la barbilla embrión. Electroporaciones se consiguen con un electroporador BTX830 programado para entregar cinco pulsos de 30 V de 50 ms de duración, separadas por intervalos de 950 mseg. Estos ajustes son para el modelo BTX830. Otros sistemas pueden ser utilizados de acuerdo con INSTRUCCIO fabricantens.
2. Todo el hemisferio Preparación del explante
- Después de la electroporación de los embriones se colocan de nuevo en hielo-frío HBSS. El cerebro es removido con dos pinzas de joyero º 5 para quitar la piel y el cráneo cartilaginoso de la cabeza del embrión. Una pinza se desliza entonces debajo del cerebro para eliminar el cerebro intacto del cráneo. El hemisferio electroporated (izquierda) se diseca lejos del cerebro y apegado a mediados de tejido cerebral se elimina. Durante todo el procedimiento de disección cuidado se toma para no dañar las meninges que recubren el hemisferio cortical izquierdo.
- Una vez diseccionado cada embrión se transfiere en HBSS utilizando una pipeta con un corte de punta de pipeta 1 ml. El hemisferio está expulsarlo lentamente hacia una inserción de colágeno cultura revestido. Hasta seis explantes hemisferio están dispuestas lado medial hacia abajo en cada inserción de 24 mm. Una vez dispuestas, HBSS en exceso se elimina de la pieza de inserción y la pieza de inserción se coloca a continuación en uno 35 mm pocillo de una placa de 6 pocillos. El pozo contiene exactly 2,7 ml de medios de comunicación: DMEM-F12 medio que contenía Glutamax y suplementado con 2% de B-27, 1% G5 y 1% de penicilina-Strep. Unas pocas gotas de los medios de comunicación del bien puede ser una pipeta en la parte superior de cada explante, pero no añadir medios de comunicación por encima de la original de 2,7 ml por pocillo.
- Una vez que los explantes han sido colocados sobre filtros de colágeno de la placa de 6 pocillos que contiene los explantes se coloca en un Billups Rothenberg (BR) de la cámara (que también contiene un plato de humidificación de agua). Un 95% / 5% de oxígeno / CO 2 mezcla de gases se infunde en la cámara durante al menos 1 min antes de sellar el cierre de cámara y desconectar el 95% / 5% de oxígeno / CO 2 tubo de suministro de gas. La cámara de BR se coloca entonces en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejido para el resto del período de cultivo, 1-2 DIV.
3. La fijación del tejido de explante para histología
- En una campana de humos preparar la solución de fijación Pagano por primera solubilizante 8 g de paraformaldehido en 100 ml de precalentado (~ 80 & deg; C) ddH 2 O. Añadir 1-3 gotas concentradas de NaOH para promover la solubilización y revuelva suavemente. Una vez solubilizado mezclar la solución de paraformaldehído al 8% 1:1 con una solución que es 500 mM de sacarosa, 100 mM de Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl, para una concentración final de 4% de paraformaldehído en 250 mM de Hepes 50 mM de sacarosa , 25 mM de MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
- Para solucionar los explantes calentar la solución de arreglo Pagano a 37 ° C. Quite rápidamente la mayoría de los medios de comunicación DMEM/F12 de cada pocillo de cultivo y añadir 5 ml de Fix Pagano a cada pocillo de explantes. Asegúrese de cubrir completamente cada explante en fijo. Fijar durante 1 hora a RT. No retire explantes de filtro antes de 1 hora de la fijación.
- Después de la fijación eliminar la solución de arreglo Pagano y reemplazar con solución Pagano sin fijar (250 mM de sacarosa 50 mM Hepes, 25 mM de MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Añadir unas gotas de azida de sodio al 10% y se almacena a 4 º C hasta su incorporación.
4. Incorporación y Sectioning para histología
- Preparar una solución de piel de ternero 10% de gelatina por solubilización de 10 g de gelatina de piel de ternera en 100 ml de agua caliente (55-60 ° C). Coloque solución de gelatina en un plato caliente ajustado a 60 ° C y agitar periódicamente hasta solubilizado.
- Vierta aproximadamente 10 ml de la solución de gelatina al 10% en la parte inferior de una placa de Petri de 10 cm y 30 min para permitir que solidifique. Esto formará un "pad" para incorporar los explantes. Estas pastillas pueden ser preparadas de antemano días y se almacenó a 4 ° C. Use una regla para dibujar una cuadrícula en la parte inferior de la placa de Petri y transferir los explantes individuales en cada cuadro de la cuadrícula. Eliminar residual solución Pagano y usando una pipeta, cubrir cada explante con solución caliente 10% de gelatina y dejar que se solidifique. Reanudar la adición lenta de la solución de gelatina hasta que cada explante está completamente rodeada por gelatina, teniendo cuidado de no fundir la almohadilla por la adición de demasiado caliente gelatina a la vez. Permita que la gelatina se endurezca durante aproximadamente 1 hora. Una vez endurecido el indiexplantes UAL puede ser cortada en pequeños bloques de gelatina. Los bloques se después de la fijada en Pagano fijar durante 24-48 horas antes de seccionar con un vibrátomo.
- Los explantes en bloques de gelatina se coloca bulbo olfatorio y seccionada en el plano coronal a 100 m de espesor. Las secciones se recogen y almacenan en PBS + azida sódica al 0,1% a 4 º C hasta su procesamiento inmunohistoquímico.
- Detección inmunohistoquímica se realiza mediante la transferencia de las secciones en una placa de 24 pocillos (2-3 secciones por pocillo). Primer bloque no específica de unión del anticuerpo mediante la adición de 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 y 2% de BSA) a cada pocillo, se incuba 1 hora con agitación suave. El anticuerpo primario apropiado es entonces diluido en PBST + B y 0,4 ml por pocillo se añaden para la incubación durante la noche a RT. La primaria se lavó con 3X lavados de PBS durante al menos 10 min cada uno. El anticuerpo secundario y 2 g / ml Hoechst 33342 tinción nuclear se diluyen a continuación en PBST + B y las muestras se incubaron durante 2 horas a RTcon agitación suave. Tres lavados con PBS (10 min cada una) se llevan a cabo y, a continuación, las secciones se montaron sobre portaobjetos utilizando un 90% de glicerol 50 mM Tris, pH 7,4, los medios de montaje.
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Resultados
La corteza de embriones de roedores exhibe un gradiente transversal neurogenético durante todo el período de desarrollo, de manera que neocórtex lateral es de aproximadamente 1 día más maduro que dorsal medial neocórtex 28. El grueso de la capa 6 neuronas se generan en (es decir, exhiben su final de la fase S) en E12 en la corteza lateral (también llamado campo 40 5) y en E13 en la corteza medial dorsal (también llamado campo 1 5). Dividir la presiembra se inicia aproximadamente...
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Discusión
Hemos mejorado y evaluó un modelo experimental - explantes enteros hemisferio - para el estudio del desarrollo cortical temprano (E13-E15). El modelo ha demostrado ser útil para el análisis de la migración y la diferenciación del linaje neurona excitatoria que constituye la capa 6 de la corteza cerebral 25,37. Las principales ventajas del sistema son: 1) el crecimiento organotípico para DIV 2, 2) la sencillez de la preparación, y 3) el acceso experimental a las neuronas para la electroporación, la manipulació...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Agradecimientos
Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones (NINDS NS066071) y el NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Los autores agradecen al Dr. Robert Quinn y el personal del Departamento de Recursos Animales de laboratorio para el cuidado de los animales. Damos las gracias a Judson Belmont para el apoyo técnico, Nicole Belletier de asistencia como miembro de Verano de Investigación de Pregrado (SURF). También agradecemos al Dr. David Cameron y edita los comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Suplemento 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pluma / Estreptococo Líquido 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Inserto de cultivo recubierto de colágeno | Costar | 3492 | |
| Gelatina de piel bovina | Sigma | G9382 | |
| H– chst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus 450052 | ||
| Electrodos de pinza 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubadora | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Jeringa Hamilton (5uL) | Hamilton | 87930 | |
| Aguja de jeringa Hamilton | Hamilton 7803-04 | Especificar 1" y estilo 4 | |
| Pinzas Dumont #5 | FST | 11251-10 | |
| Tijeras Finas Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
Referencias
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