Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que implica Ex utero Electroporación, la disección y la cultura de la totalidad de los hemisferios cerebrales del ratón embrionario. La preparación facilita los estudios farmacológicos y ensayos de la función de genes durante el desarrollo cortical temprano.

Resumen

Desarrollo cortical implica interacciones complejas entre las neuronas y no neuronales elementos incluyendo células precursoras, los vasos sanguíneos, las meninges y la matriz extracelular asociada. Debido a que proporcionan un entorno adecuado organotípico, los explantes corticales rebanada se utilizan a menudo para investigar las interacciones que controlan la diferenciación neuronal y el desarrollo. Aunque es beneficioso, el modelo de explante rebanada puede sufrir de inconvenientes que incluyen la laminación celular aberrante y la migración. Aquí mostramos un todo sistema cerebral explante hemisferio para estudios de desarrollo temprano cortical que es más fácil de preparar que las rebanadas corticales y programas de migración coherente organotípico y laminación. En este modelo de sistema, laminación principios y patrones de migración continuará normalmente durante un período de dos días in vitro, incluido el período de dividir la presiembra, durante el cual la capa cortical prospectivo seis formas. Desarrollamos entonces un ex electroporación in utero (EUEP)enfoque que logra el éxito ~ 80% en la selección de buenas prácticas agrarias expresión en las neuronas en desarrollo en la corteza medial dorsal.

El modelo de explante hemisferio entero hace que el desarrollo temprano cortical accesible para la electroporación, la intervención farmacológica y enfoques en vivo de imágenes. Este método evita la cirugía supervivencia requeridos en el útero de la electroporación (IUEP) enfoques al tiempo que mejora tanto la transfección y la consistencia de área de focalización. Este método facilitará los estudios experimentales de la proliferación neuronal migración y diferenciación.

Introducción

Las formas de la corteza cerebral de mamíferos a través de la proliferación concertada migración y diferenciación de las neuronas generadas sucesivamente. Cada neurona nace en la zona ventricular (VZ) y migra desde el VZ en la zona intermedia (IZ), formando la placa cortical (CP) ^1. A medida que pasan a través de diferentes dominios corticales, las neuronas que migran mostrar múltiples modos de migración ^2,3 que dependen del ambiente extracelular y otros elementos celulares (por ejemplo, la glía radial) dentro del tejido en desarrollo. Las neuronas corticales entonces detener la migración en la parte superior de la placa de conformación....

Protocolo

1. Electroporaciones Ex utero con Expression proteína verde fluorescente plásmido

1. Plásmido de ADN soluciones de inyección se preparan con CAG-eGFP ADN ²⁷ diluido a la concentración de trabajo final de 0,33 mg / ml en ddH ₂ O. Qiagen Endo-gratis-Maxi Preps se utilizan para purificar el plásmido a partir de bacterias transformadas. Colorante verde rápido en ~ 0,02% (w / v final) se añade a la solución de ADN como un trazador de inyección.
2. Para preparar el área quirúrgica, rocíe mesa de trabajo y la etapa microscopio de disección con una solución de etanol al 70% y secar. Rocíe tijeras y pinzas quirúrgicas, con 70% de ....

Resultados

La corteza de embriones de roedores exhibe un gradiente transversal neurogenético durante todo el período de desarrollo, de manera que neocórtex lateral es de aproximadamente 1 día más maduro que dorsal medial neocórtex ^28. El grueso de la capa 6 neuronas se generan en (es decir, exhiben su final de la fase S) en E12 en la corteza lateral (también llamado campo 40 ⁵⁾ y en E13 en la corteza medial dorsal (también llamado campo 1 ^5). Dividir la presiembra se inicia aproximadamente.......

Discusión

Hemos mejorado y evaluó un modelo experimental - explantes enteros hemisferio - para el estudio del desarrollo cortical temprano (E13-E15). El modelo ha demostrado ser útil para el análisis de la migración y la diferenciación del linaje neurona excitatoria que constituye la capa 6 de la corteza cerebral ^25,37. Las principales ventajas del sistema son: 1) el crecimiento organotípico para DIV 2, 2) la sencillez de la preparación, y 3) el acceso experimental a las neuronas para la electroporación, la manipulació.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Suplemento 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pluma / Estreptococo Líquido 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Inserto de cultivo recubierto de colágeno	Costar	3492
Gelatina de piel bovina	Sigma	G9382
H– chst 33342	Invitrogen	H1399
Albúmina sérica bovina	Sigma	7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Electroporator	Harvard Apparatus 450052
Electrodos de pinza 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubadora	Billups Rothenberg	MIC-101
Jeringa Hamilton (5uL)	Hamilton	87930
Aguja de jeringa Hamilton		Hamilton 7803-04	Especificar 1" y estilo 4
Pinzas Dumont #5	FST	11251-10
Tijeras Finas Tough Cut 9 cm	FST	14058-09