Summary
Somitogenesis är en rytmisk utvecklingsprocess som rumsligt mönster kroppsaxel ryggradsdjur embryon. Tidigare utvecklade vi transgena zebrafisk linjer som använder fluorescerande reportrar att följa de cykliska gener som driver denna process. Här, vi kultur spridda celler från dessa linjer och bild deras svängningar över tiden in vitro.
Abstract
Segmentering är en periodisk och sekventiell morfogenetisk process hos ryggradsdjur. Denna rytmiska bildningen av block av vävnad som kallas somites längs kroppsaxeln är bevis för en genetisk oscillator mönstring det växande embryot. I zebrafisk, är den intracellulära klockan driver segmentering som består av medlemmar i Hennes / Hes transkriptionsfaktor familj organiserade i negativa återkopplingar. Vi har nyligen genererat transgena fluorescerande reporter linjer för den cykliska genen HER1 att rekapitulera det spatiotemporala mönster av svängningar i presomitic mesoderm (PSM). Med hjälp av dessa rader, har vi utvecklat en in vitro-kultur-system som möjliggör realtidsanalys av segmenteklock svängningar inom enskilda, isolerade PSM celler. Genom att ta bort PSM vävnad från transgena embryon och sedan dispergering celler från oscillerande regioner på glasbottnade rätter, vi genererat kulturer lämpliga för time-lapse avbildning av fluorescenssignal frånindividuella klock celler. Denna metod ger en experimentell och konceptuell ram för direkt manipulation av segmente klocka med oöverträffad encelliga upplösning, så att dess cell-autonoma och vävnadsnivå egenskaper särskiljas och dissekeras.
Introduction
Den periodiska bildandet av segment längs ryggradsdjur kroppsaxeln, eller somitogenesis, är ett bevis på en rumslig och tidsmässig oscillatorn i det växande embryot. Den gynnade mekanism kontrollerande somitogenesis är konceptuellt beskrivs av en "klock-och vågfront" modell 1, varvid den "klocka" som består av cell-oscillatorer, som nu tros vara intracellulärt driven av den rytmiska uttrycket av en uppsättning av cykliska gener 2, fästingar av bildandet av somiter från presomitic mesoderm (PSM). När embryot utvecklas, en mognads "vågfront" i PSM rör sig i samförstånd med regressing vävnaden mot den bakre, bromsa och arrestera cellulära oscillatorer när den passerar 3. Tillsammans är detta spatiotemporally dynamiskt system betecknas segmente klocka. Nuvarande metoder för att studera segmente klockan span tre ökande organisation från den genetiska oscillatorn i enstaka celler till lokala kopplings: evid sker mellan celler och slutligen till global reglering av positionsinformation i det kollektiva PSM vävnaden 4.
Tidigare studier tyder på att cellautonoma segmente oscillator i zebrafisk består av gener och proteinprodukter från hennes / hes transkription factorfamily, som är tänkt att bilda en negativ återkoppling genom transkriptionell repression 5-7. Delta / Notch signalväg synkroniserar svängningar mellan angränsande celler och reglerar den kollektiva period av befolkningen 8-10. FGF signalmolekyler som produceras i tailbud tycks bygga en gradient över zebrafisk PSM, och är därmed en hypotes för att bidra till att bromsa och arrestera oscillerande celler i främre 11. Hittills har de funktionella roller var och en av dessa molekyler i somitogenesis undersökts av genetisk mutation, morfolino injektion, värmechock överuttryck, och antagonist drog treatment klockkomponenter och signalering mellan celler 5,7,10,12. Med hjälp av dessa störningar, har segmente klocka funktion utläsas beskrivningar vävnad nivå för somit fel och förlust av enhetliga svängningar i uttryck av cykliska gener som HER1, her7 och delta C. Men nästan alla dessa data från fasta embryon och misslyckas med att exakt fånga förändringar som är förbundna med den dynamiska funktion segmenteklockan. På senare tid har flera embryo tidsförlopp imaging avslöjade de första mutanter med förändrad oscillator perioden, men dessa observationer gjordes även på vävnadsnivå 7,13. Sålunda har beteendet hos den hypotes cellautonoma oscillator under somitogenesis inte observerats.
Statiska ögonblicksbilder av somitogenesis ger en ofullständig bild, därför, i sig, är den process som drivs av en oscillerande-system. Tidigare arbete i mus-och chick-celler visade att halterna av avskriftoch protein uppgång och fall, men provtagning en ca 2 tim svängning var 30 eller 45 minuter med nödvändighet begränsar de insamlade uppgifterna och därmed de slutsatser som kan dras 14,15. Studie av andra biologiska oscillatorer, notably, dygnsklockan, har flyttat bort från iscensatta mätningar av gen-och proteinuttryck för övervakning i realtid med hjälp av fluorescerande och självlysande reportrar 16,17. Dessa verktyg är nödvändiga för att visa klock egenskaper hos enskilda celler 18. En självlysande reporter på Hes1 cykliska gen har utvecklats och i korthet kännetecknas av enkla mus-PSM-celler 19. Den genomsnittliga tiden och variansen beräknades för ett litet antal celler, som visar att svängningar kvar i flera cykler in vitro. Dock har dessa studier inte kvantitativt behandla stabilitet och robusthet oscillator frekvens och amplitud, oavsett om cellerna spontant kan komma in eller exit svängningar,och hur cellerna bibehålla sina fasrelationerna. Dessutom är effekterna av signalmolekyler som finns i embryot på cellautonoma klockan har inte direkt testat. Följaktligen dessa grundläggande egenskaper hos en enda cell oscillatorn förblir helt okänd.
Vi har nyligen utvecklat transgena fiskar linjer med BAC recombineering 20 för att driva Venus (YFP) fluorescens reportrar i HER1 uttryck 30. Sådana linjer utnyttja de regulatoriska signaler i den intakta kromosomala locus där de är inbäddade och rekapitulera de temporala dynamik och rumsliga mönster av HER1. Detta genombrott möjliggör realtidsövervakning av genuttryck i utvecklingszebrafisk embryot in vivo. För att studera de grundläggande egenskaperna för cell-autonoma svängningar och hur sådana uttryck regleras över tid, nyligen utvecklade vi en tillförlitlig metod för att isolera och spela in från PSM-celler in vitro. Detta protocol beskriver hur vi har utnyttjat våra transgena reporter linjer att generera spridda cellkulturer, som vi kan karakterisera svängningarna i den zebrafisk segmente klockan i enskilda celler. Vi kan på så sätt ta itu med kvarstående frågor inom området som inte var tillgänglig med statisk eller vävnadsnivå analys samt direkt manipulera segmenteklockan på enskild cellnivå med signalmolekyler och inhibitorer.
Protocol
1. Före Dissection
- På dagen före dissekering, skaffa embryon från en incross av zebrafisk par heterozygota för den transgena allelen.
- Höj embryon i E3 medium utan metylenblått vid 28 ° C tills sköld skede (6 timmar efter befruktning).
- Överför embryon i E3 medium utan metylenblått till 20 o CO / N. Vid 20 ° C, kommer embryona bildar 1 somit per timme när de når tailbud stadium. Efter 17-20 timmar O / N vid 20 ° C, bör embryon vara 5 till 8 somit scenen följande morgon i början av dissektion protokollet.
- Montera verktyg och reagens som behövs för dissekering.
- Brand-polerat glas pipett för överföring av embryon och vävnad
- Par fina pincett för att avlägsna chorions från embryon
- Sylgard-belagda 35-mm skål för dissekering - Häll Sylgard polymer in i en 35 mm skål och bota O / N i en 37 ° C. Gör dissekering väl användaen nålspets för att avlägsna en liten volym av härdad polymer. Skålen kan rengöras och därefter återanvänds.
- Vässade, plattade volfram tråd verktyg för PSM vävnad manipulation
- Micro-skalpell för att skära önskade bitar av PSM till kultur
- 35-mm plast skålen för trypsin inkubation
- L15-medium innehållande 10% fetalt bovint serum
- 0,25% trypsin / EDTA-lösning
- Sigmacoted gel-lastning tips för spridning
- Petriskålar av plast innehållande E3 medium utan metylenblått.
- Täck glasbotten imaging skålen med Fibronectin1 substrat (10 mikrogram / ml i PBS). Låt skålen på bänken till rock under dissekering.
- Använd stereoskop med lämpliga fluorescensfilter för att identifiera och sortera positiva transgena embryon (5-8 somit etappen).
- Identifiera transgena embryon genom att undersöka presomitic mesoderm (PSM) för YFP expression under fluorescenskanal (Figur 1A). Fluorescens should synas i regionen från den sist bildade somit till tailbud. Välj embryon med ljussignalen; 25% av avkomman bör vara homozygota Embryon som 2 kopior av transgenen. Antalet identifierade embryon som behövs varierar beroende på experimentet. Man dissekerade tailbud pjäs kommer att ge 1000 celler, i genomsnitt. Vanligtvis några ytterligare positiva embryon är användbart om fel görs under dissekering.
- Använd transmitterat ljus som en positionell referens för att särskilja varje autofluorescens, särskilt i gulan cell, från signalen.
- Överför positiva embryon till en separat plastpetriskål med E3 medium utan metylenblått.
2. PSM Dissection och Spridning
- Förbered embryon för dissekering.
- Enligt en dissektion mikroskop, med fin pincett, försiktigt bort chorion från varje embryo i E3-medium. Se till att inte skada embryot eller störa äggulan cellen. Fyll Sylgard-belagd dissekera skålen med L15 medium med serum. Använd pincett eller annat platt verktyg, ta bort eventuella luftbubblor från ytan av Sylgard.
- Överför dechorionated embryon med hjälp av eld-polerat glas pipett till dissekering skålen.
- Med hjälp av trådverktyg, flytta alla embryon till ena sidan av dissekera skålen.
- Dissekera PSM från ett enda embryo.
- Orient ett enda embryo på sin laterala sidan i den lilla välgjord i Sylgard lagret i dissekera skålen (Figur 1B).
- Med hjälp av mikro-skalpell, skiva genom embryot och äggula cell bara främre till bakhjäman och genom den ventrala polen av embryot (Figur 1B, prickad röd linje).
- Ta bort den främre del av embryot från brunnen, flytta den åt sidan av skålen, och sedan använda trådverktyg för att skrapa bort resterande äggula cell granulat från den bakre sektionen inklusive PSM.
- När äggulan har skrapats bort, platta och orientera PSM med den främre änden pekar bort från försöksledaren och den bakre pekar mot försöksledaren (Figur 1C).
- Om det tunna lagret av ektoderm inte har dragit av vid det här laget, använd tråd verktyg för att dra bort den från toppen av PSM vävnaden.
- Med hjälp av mikro-skalpell skär tailbud, den bakre spetsen av PSM förbi i slutet av notochord, bort från resten av vävnaden (Figur 1C, prickad röd linje). OBS: Andra bitar av vävnad från PSM, t.ex. främre PSM närmare den senaste bildade somit, också kan tas i kultur, beroende på den experimentella frågan.
- Flytta tailbud bit till ett hörn av skålen bort från dissekera området. Använd tråd verktyg för att rensa skräp och oönskad embryo vävnad från dissekera fältet.
- Upprepa med nästa embryot.
- Pool tailbud bitar från flera embryos, beroende på hur många celler som kommer att krävas för experimentet. I genomsnitt är ett enda stycke av tailbud vävnad ger 1000 celler.
- Fyll tom 35-mm plastskål med en liten volym av trypsin-EDTA.
- Använda brand-polerat glas pipett tailbud bitar från dissekera skålen i skålen som innehåller trypsin / EDTA. Inkubera tailbud bitar i trypsin / EDTA under 20 min vid RT.
- Medan vävnaden inkuberas i trypsin, avlägsna Fibronectin1 lösningen från glasbottnad avbildning skålen.
- Tvätta lösningen från glas 3 gånger med MilliQ vatten. Använd sug för att ta bort varje tvätt och se till att skålen är helt torr.
- Dispergera tailbud bitar i medium för avbildning.
- Pipettera 100 l av L15-medium med serum i bildbehandling maträtt.
- Med hjälp av en belagd gel tips, ta bort tailbud bitarna från trypsin / EDTA i en så liten volym som möjligt.
- Pipettera tailbud bitar in i mediet iimaging maträtt. Pipet bitarna upp och ner flera gånger för att bryta isär dem och suspendera cellerna i mediet. Var noga med att inte införa luftbubblor. Kontrollera om cellklumpar under mikroskop och sprida mer efter behov.
- Tillåt dispergerade cellerna i suspensionen att sedimentera på Fibronectin1 belagda glas för 20 min vid rumstemperatur.
- Lägg till en liten volym av ytterligare L15 medium med serum till cellerna innan avbildning. Var försiktig att inte störa förfallna likvider celler.
- Med tanke på den experimentella frågan, lägga till några kompletterande eller läkemedelsbehandlingar till kulturen.
3. Avbildning av Spritt PSM celler
- Ställ in imaging skålen i temperaturkammare på time-lapse avbildning mikroskop. Ställ Warner kammaren till önskade temperaturen för experimentet. Låt skålen för att stabilisera sig i minst 30 minuter innan bilden förvärvet. Crosscheck temperatur med sond extern temperatur placeras i skålen, om så krävs. OBS: På grund avsambandet mellan temperatur och somitogenesis hastighet 21 stabil temperaturreglering är avgörande för noggranna mätningar av tid i enstaka PSM celler.
- Förvärva testbilder i fluorescenskanalen för att kontrollera att den tid och få exponering ger ett stort dynamiskt område av intensiteter utan mättnad för att säkerställa god signal till brusnivåer. En typisk fluorescens bild förvärvats från spridda celler som genereras från våra linjer använder denna protokollet kräver 400 ms och 40 ms för en genomlysning bild med en EMCCD kamera arbetar vid en EM Gain av 85. Dessutom pre-amp förstärkning och avläsningshastighet från Kameran är också viktigt för att maximera signal över buller.
- Med hjälp av genomlysning kanal, välj fält av celler för time-lapse förvärvet.
- Kör tidsförlopp förvärvsprotokoll för önskad tid.
- Förvärva en genomlysning och en fluorescens bild per fält. OBS: Ställ in ett intervall mellan förvärvs roFONDERNA som kommer att fånga tidsmässiga dynamiken utan foto-blekning över förlängd avbildning eller förmå toxicitet i cellerna. Detta protokoll använder en 2 min intervall.
- Kontrollera tidsförlopp ställa upp då och då under inspelningen för att se till att cellerna förblir i fokus, ingen mjukvara eller hårdvara fel, etc.
4. Bildbehandling av förvärvade Time-lapse-filmer
- Öppna filmfil för en förvärvad fält i ett bildbehandlingsprogram. OBS: Fiji användes för all behandling i detta protokoll.
- Split genomlysning och fluorescens ramar från ett fält för att skapa 2 högar av bilder.
- Spår en enda cell i den överförda ljuskanal.
- Placera en cirkulär ROI (regionen av intresse) runt den valda cellen i den första ramen i den överförda ljuskanal. OBS:.. Endast celler som 1 är friska i slutet av inspelningen, 2 inte rör sig utanför området, och 3 inte kommer i kontakt med andra ce.lls spåras.
- Spara en ROI med några ramar till ROI manager. Spåra cell till sista bildrutan.
- Mät intensitet genom att använda sparade ROI på fluorescenskanalen.
- Markera fluorescens stacken och med den sparade ROI, använd den anpassade cirkeln interpolatorn plug-in och makro för att mäta intensiteten av den spårade cellen över tiden.
- Kontrollera utgångs spår från makro. Om spårningen fångar kvalitativt funktioner i fluorescens tidsförlopp, exportera värdena till ett Excel-kalkylblad.
- Save the ROI lista för cellen.
- Upprepa spårning i överförd kanal och mätning av fluorescens-kanalen för andra celler i fältet.
- Upprepa alla steg för ytterligare fält från experimentet.
Representative Results
Detta protokoll producerar kulturer av livskraftiga, spridda, enstaka PSM celler för time-lapse avbildning av fluorescenssignal (Figur 2). Vår transgen genererar en reporter vars cykel av produktion och nedbrytning sker med liknande dynamik till den endogena genen och protein i embryot, i storleksordningen en halv timme. På grund av dess snabba omsättningen bör YFP signalen i enskilda celler upptäckas snabbt för att minimera blekning och med en hög tidsupplösning för att fånga funktionerna i varje oscillerande cykel. Dessutom, med tanke på den relativa dunklet av signalen, kultur-och förvärvsförhållanden har noggrant avstämd för att säkerställa känsliga och robusta resultat. Vi har funnit följande faktorer att vara viktiga för att generera optimala PSM cellkulturer för avbildning:. 1 En ECM substrat som används för beläggning av glasbottnade kultur rätter. 2. Tillsättning av serum för dissekering och bildalstringsmediumet. 3. Dissektion av PSM från identifierade embryon tagna efter parning heterozygous par, vars avkomma potentiellt bära två kopior av transgenen. 4. Bild förvärv inom ett optimalt förstoringsområde, med hjälp av en högre NA målet att säkerställa effektiv insamling av fluorescenssignalen. 5. Belysning med en SSD-ljuskälla för att minimera intensitetsvariationer som kan bidra till bakgrundsljud. 6. Signal detektion med en mycket känslig EM-CCD-kamera för att maximera signal avläsning.
Suboptimala kulturer kommer att innehålla celler som inte förblir rundad och friska genom hela inspelningen. Vi antar att vår ECM-substrat, ett fragment av zebrafisk fibronectin1 håller cellerna i ett odifferentierat PSM-liknande tillstånd, i jämförelse med andra vanligen använda substrat såsom poly-lysin eller laminin. Andra substrat som vi testade orsakat celler att platta på glaset och förlusten av oscillerande fluorescerande signal under loppet av inspelningen. Vi fann också att tillsats av serum till mediet under dissektion, spridning,och inspelning var inte bara viktigt för att släcka trypsin används för dissociation, men även ökad fluorescens intensitet över bakgrunden, sannolikt på grund av förbättrad cellernas livskraft. För att säkerställa optimal signal fånga från enstaka celler använde vi en 40x objektiv speciellt för fluorescens avbildning (Zeiss Plan NeoFluor serien) med en hög NA. Vi fann också att en solid-state ljuskälla förutsatt stabilare belysning än traditionella kvicksilverlampor, som är avgörande för att minimera bakgrundsvariationer som bidrar till brusiga bilder. Dessa ändringar är viktiga för att säkerställa robusta resultat.
Med användning av detta protokoll vi förväntar kulturer i vilka huvuddelen av celler i ett givet område är fluorescerande vid någon punkt under inspelningen. Vi finner att fluorescerande celler förblir oftast rundad och är ibland ganska rörliga under inspelningarna. Några celler, inklusive fluorescerande celler, kan bli apoptotiska under inspelningen. Dessa celler är undantagna från alla aANALYS. Vi utesluter också celler som kommer i kontakt med andra celler eller flytta utanför synfältet. I genomsnitt ser vi en minskning av 12% av antalet celler per fält i slutet av den 10 h inspelning mätt genom räkning av antalet friska celler i den överförda ljuskanal. Denna förlust inkluderar både död och celler som har flyttat ut ur fältet cellen. Givet dessa förbehåll kan vi, i genomsnitt, spår 5 fluorescerande celler per fält som förblir livskraftiga och synliga, och typiskt spela 6 fält per tillstånd. Till exempel kommer ett experiment med fyra villkor har 24 sammanlagda fält förvärvats och typiskt ca 30 spårade celler per tillstånd. Under standardavbildningsförhållanden med L15 medium innehållande 10% fetalt bovint serum, finner vi att PSM celler (n = 101 celler från 4 experimentella replikat) kan producera mellan 2 och 7 toppar, med medelvärdet och standardavvikelse på 3 ± 1 toppar (2 -3 cykler). Mediantoppnummer, samt 25% percentilen, är 2 toppar och 75% percentilen is 3 toppar. Med vår halvautomatiska spårning och analys, kan vi snabbt skapa fluorescensintensiteten över tiden spår för enskilda PSM-celler, med en representativ cell spår som visas i figur 2C. Dessa råa spår kan sedan användas för att göra kvantitativa mätningar av egenskaper hos de oscillerande PSM-celler, såsom frekvens, amplitud, antal cykler, och tidpunkten för toppar.
Figur 1. Identifiering av transgena embryon och scheman för deras dissektion. (A) sidovy av en transgen zebrafisk embryo uttrycka YFP fluorescens vid ~ 5-somit skede. Bilden är en överlagring av transmitterat ljus och fluorescenskanalen. Pilar indikerar områden av signal som startar vid spetsen av tailbud, hela PSM, mot den l ast bildad somit. Infällda bilden visar en schematisk bild av reportern transgenen (för mer information om dess utveckling och in vivo beteende avser Soroldoni et al. 30. (B) Schematisk bild av lateral bild av embryot före första klippa under dissektion. Prickad röda linjen visar den första snittet görs över bakhjäman, men äggulan cellen precis bakom tailbud. (C) Schematisk bild av tillplattad PSM efter avlägsnande av äggula granulat och epidermal lagret, orienterat längs dess främre-bakre axeln. Prickad röda linjen indikerar den andra snitt för att ta bort spetsen av tailbud för spridning och kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
07fig2.jpg "/>
Figur 2. Bilderna och spår från en enda cell i en spridd PSM kultur. (A) Montage av genomlysning bilder av en enda PSM cell i ett 6-h inspelning med tidsluckor. Observera att cellen förblir rundade och friska under hela inspelningen. (B) Motsvarande montage av fluorescens bilder från en enda PSM cell. Toppar i intensitet hos cellen är numrerade under loppet av inspelningen. (C) Genomsnittlig intensitet över tiden mäts från en ROI placerades på denna cell. Värdena är tagna från varje bildruta från en film med en bildhastighet av en per 2 minuter med hjälp av cirkel interpolatorn plug-in och anpassade makro skriven i Fiji. Peaks i intensitet igen numrerade genom hela spåret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Att studera en cellulär process som sker under loppet av embryonal utveckling, biologer använder vanligtvis en ståndpunkt inom ramen för hela embryot. Men för att till fullo förstå hur en enda cell beter sig inom en utvecklande tid, är en metod för att undersöka och störa enskilda celler för sig också till stor nytta. Genom att generera spridda PSM cellkulturer med hjälp av transgena zebrafisk embryon som vi nu har ett verktyg för att direkt studera cellsjälvständiga karaktär genetiska svängningar i segmente klockan på ett kvantitativt sätt. Det är möjligt att mäta dynamiken av oscillationerna i vår fluorescerande reporter i hundratals celler under en mängd olika förhållanden.
Den observerade period av enstaka celler i odling är längre än den somitogenesis period i intakt embryo. Vi observerar att en intakt PSM Explantation i kultur uppvisar också långsammare svängningar än den intakta embryot (data visas ej), vilket tyder that det längre tid observerats i isolerade celler är inte bara på grund av skador från spridning. En variabel period och amplitud observeras i de flesta av våra encelliga tidsserier. Källan till denna variation är okänd, men bör avslöja viktiga detaljer om segmente klockans pace-making kretsar.
Med denna metod kan vi studera de genetiska komponenterna i segmentering på cellnivå, och adress frågor som är utmanande att undersöka i hela embryot. Till exempel genom kontrollerad tillsats av kända signalmolekyler som finns i det växande embryot till våra kulturer, kan vi undersöka deras effekter på den enda PSM cellulära oscillator i en robust och reproducerbar analys. Vårt PSM odlingssystem öppnar dörren till en rigorös utvärdering av vilka faktorer, ensamma eller i kombination främjar svängningar i dessa celler, vilka faktorer som hämmar dessa svängningar, och att testa samspelet mellan dessa molekyler. Med dessa verktyg i handen, strävar vi efter attutvärdera befintliga modeller av somitogenesis som baseras på publicerade vävnadsnivå uppgifter samt användning resulterar i enstaka celler för att generera förutsägelser som kan testas i hela embryot.
Såvitt vi vet är detta den första zebrafisk primär cellodling protokoll för akut time-lapse inspelning av fluorescens i enstaka celler; vidareutveckling och förfining av detta protokoll är utan tvekan möjligt. Andra protokoll använder ofta zebrafisk embryon för att skapa stabila cellinjer som kan transfekterade med reportrar och används för långsiktig avbildning 27-29. Även stabila linjer är användbara för att avbilda en process som inte är knuten till utveckling timing, såsom dygnsrytm klocka, frågan om embryonala segmentering kräver omedelbar avbildning medan cellerna fortfarande är i sin oscillerande, stamfader tillstånd. När cellerna slutar oscillerande, antar de en differentierad cell öde, och då i vävnaden skulle införlivas i en somit. Det är possible att vi med rätt faktor eller faktorer i vitro skulle kunna generera PSM-liknande zebrafisk cellodlingslinjer som skulle förbli oscillerande, möjliggör betydligt mer långsiktiga observationer, multipla sekventiella störningar, eller high-throughput screening.
Vi förväntar oss att denna metod för framställning av primära kulturer av spridda celler för time-lapse avbildning är väl lämpad för studier av någon cellulär process som sker inom en utvecklande tid som inte är lättillgänglig med hjälp av stabila zebrafisk cellinjer. Isoleringen av olika celltyper i olika utvecklingsstadier från lämpliga transgena reporter linjer, antingen via dissektion eller via FACS efter embryonala dissociation, kan ge utgångsceller. Viss optimering av odlingsbetingelser, styrs av den embryonala ursprunget för de celler, kan krävas. Genom att kombinera denna flexibla och känsliga protokoll med den snabbt växande samling av transgena zebrafisklinjer, hoppas vi kunna underlätta en in vitro utvecklingsbiologi strategi som kompletterar klassiska genetiska och embryologiska metoder.
Disclosures
Författare bidrag:
ABW utvecklat och förfinat spridnings, kultur, bildbehandling och spårning cell protokoll. DS genererade de transgena linjerna och övervakade utformningen av tidsförlopp fluorescensmikroskop som används i detta protokoll. AO pionjärer initiala proof-of-principle experiment för att dissociera och bild PSM celler i kultur. JS skrev cirkeln interpolatorn plugin verktyg i Fiji för att mäta fluorescensintensiteten från time-lapse filmer. ABW och ACO skrev manuskriptet.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett EMBO Långsiktig gemenskap (ABW), en National Science Foundation International Postdoctoral Research Fellowship (ABW), Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), en LYA-BB gemenskap (AO), och det europeiska forskningsrådet inom ramen för Europeiska gemenskapernas sjunde ramprogram STG-207.634 (DS, ACO). Vi tackar Ravi Desai för värdefulla kommentarer på manuskriptet. Vi vill också tacka MPI-CBG proteinuttryck anläggning för produktion av zebrafisk Fibronectin1 fragmentet, MPI-CBG fisk anläggning personal för skötsel och underhåll av våra fisklinjer och MPI-CBG ljusmikroskopi anläggning för avbildning stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epifluorescence microscope | Olympus | Model: SZX16 | |
| Epifluorescence microscope | X-cite Illumination | Series: 120Q | |
| Dissection microscope | Olympus | Model: SZX12 | |
| Fine forceps no. 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Glass transfer pipettes | Assistent | 567/2 | |
| 35 mm plastic petri dishes | Greiner | 627102 | |
| 60 mm plastic petri dishes | Greiner | 628102 | |
| Sylgard polymer | SASCO | 266727 | |
| Manipulation tools | Made in-house | For description of manipulation tools Ref. 22 | |
| Microsurgical knife | World Precision Instruments | 500249 | |
| L15 medium | Invitrogen | 57322 | |
| Penicillin/streptomyocin | PAA | P11-010 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 257322 | |
| 0.05% trypsin / 0.02% EDTA | PAA | L11-004 | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 253188 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | 254589 | |
| Micropipette set | Gilson International | F167300 | |
| Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment | MPI-CBG protein facility | Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek (single well) | P35G-1.5-14-C | |
| Glass bottom imaging dishes | Greiner (CellView -multi-well) | 262502 | |
| E3 medium without methylene blue | Made in-house | From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 | |
| Plastic transfer pipettes | Ratiolab | 260011 | |
| Warner heating/cooling chamber | Warner Instruments | TC-324B/344B | |
| EM-CCD camera | Andor | Model: iXOn 888 | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Zeiss | Model: Axiovert 200M | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | NeoFluor 40x, NA 0.75 | ||
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | Lumencor Light Engine | Model: Spectra X | |
| Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set | BrightLine HC 575/15 | F39-575 |
References
- Cooke, J., Zeeman, E. C. A clock and wavefront model for control of the number of repeated structures during animal morphogenesis. J Theor Biol. 58, 455-476 (1976).
- Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock. Development. 139, 625-639 (2012).
- Dequeant, M. L., Pourquie, O. Segmental patterning of the vertebrate embryonic axis. Nat Rev Genet. 9, 370-382 (2008).
- Oates, A. C., Gorfinkiel, N., Gonzalez-Gaitan, M., Heisenberg, C. P.
- Oates, A. C., Ho, R. K. Hairy/E(spl)-related (Her) genes are central components of the segmentation oscillator and display redundancy with the Delta/Notch signaling pathway in the formation of anterior segmental boundaries in the zebrafish. Development. 129, 2929-2946 (2002).
- Lewis, J. Autoinhibition with transcriptional delay: a simple mechanism for the zebrafish somitogenesis oscillator. Curr Biol. 13, 1398-1408 (2003).
- Schroter, C., Oates, A. C. Segment Number and Axial Identity in a Segmentation Clock Period Mutant. Curr Biol. 20, 1254-1258 (2010).
- Riedel-Kruse, I. H., Muller, C., Oates, A. C. Synchrony dynamics during initiation, failure, and rescue of the segmentation clock. Science. 317, 1911-1915 (2007).
- Ozbudak, E. M., Lewis, J. Notch signalling synchronizes the zebrafish segmentation clock but is not needed to create somite boundaries. PLoS Genet. 4, e15 (2008).
- Herrgen, L., et al. Intercellular Coupling Regulates the Period of the Segmentation Clock. Curr Biol. 20, 1244-1253 (2010).
- Sawada, A., et al. Fgf/MAPK signalling is a crucial positional cue in somite boundary formation. Development. 128, 4873-4880 (2001).
- Giudicelli, F., Ozbudak, E. M., Wright, G. J., Lewis, J. Setting the tempo in development: an investigation of the zebrafish somite clock mechanism. PLoS Biol. 5, e150 (2007).
- Herrgen, L., Schroter, C., Bajard, L., Oates, A. C. Multiple embryo time-lapse imaging of zebrafish development. Methods Mol Biol. 546, 243-254 (2009).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquie, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int J Dev Biol. 49, 309-315 (2005).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R.
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Soroldoni, D., Oates, A. C. Live transgenic reporters of the vertebrate embryo's Segmentation Clock. Curr Opin Genet Dev. 21, 600-605 (2011).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Soroldoni, D., Hogan, B. M., Oates, A. C. Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in zebrafish. Methods in molecular biology. 546, 117-130 (2009).
- Schroter, C., et al.
- Picker, A., Roellig, D., Pourquie, O., Oates, A. C., Brand, M.
- Mould, A. P., et al. Identification of multiple integrin beta1 homologs in zebrafish (Danio rerio). BMC Cell Biol. 7, 24 (2006).
- Mould, A. P., Koper, E. J., Byron, A., Zahn, G., Humphries, M. J. Mapping the ligand-binding pocket of integrin alpha5beta1 using a gain-of-function approach. Biochem J. 424, 179-189 (2009).
- Zhao, Q., Liu, X., Collodi, P. Identification and characterization of a novel fibronectin in zebrafish. Exp Cell Res. 268, 211-219 (2001).
- Westerfield, M. In The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Vallone, D., Santoriello, C., Gondi, S. B., Foulkes, N. S. Basic protocols for zebrafish cell lines: maintenance and transfection. Methods Mol Biol. 362, 429-441 (2007).
- Carr, A. J., Whitmore, D. Imaging of single light-responsive clock cells reveals fluctuating free-running periods. Nat Cell Biol. 7, 319-321 (2005).
- Whitmore, D., Foulkes, N. S., Sassone-Corsi, P. Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock. Nature. 404, 87-91 (2000).
- Soroldoni, D., et al. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, DOI. 222-225 (1126).
