Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

Resumen

Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED) es compatible con el análisis de la dinámica del almacén de calcio intracelular por imágenes de fluorescencia. El método basa en la orientación de un carboxilesterasa recombinante para el retículo endoplásmico (ER), donde mejora el desenmascaramiento local del sintético de baja afinidad Ca ^{2 +} Tintes indicadores en el lumen del RE.

Resumen

Visualización de la dinámica de calcio es importante para entender el papel del calcio en la fisiología celular. Para examinar la dinámica del calcio, fluorescentes Ca ^{2 +} indicadores sintéticos se han vuelto populares. Aquí demostramos TED (= carga de colorante inducida dirigido-esterasa), un método para mejorar la liberación de Ca ^{2 +} colorantes indicadores en el lumen del retículo endoplasmático de diferentes tipos de células. Hasta la fecha, el TED se utilizó en líneas celulares, células gliales y neuronas in vitro. Bases TED en eficiencia, recombinante orientación de una actividad de alto carboxilesterasa al lumen ER usando vectores construcciones que carboxilesterasas expresos (CES). Los últimos vectores TED contienen un elemento central de CES2 fusionado a una proteína fluorescente de color rojo, lo que permite simultánea de imágenes de dos colores. La dinámica de calcio libre en el ER se obtuvieron imágenes en un solo color, mientras que la estructura ER correspondiente aparece en rojo. Al comienzo del procedimiento, las células son transducidas con un lentivirus. Posteriormente, las células infectadas unare sembraron en cubreobjetos para finalmente permitir imágenes de células vivas. Entonces, las células vivas se incuban con el éster de acetoximetilo (AM-éster) de forma de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores, por ejemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. La actividad esterasa en los unirá ER frente cadenas laterales hidrófobas de la forma de AM de la Ca ^{2 +} indicador y un colorante fluorescente / Ca ^{2 +} complejo hidrófilo se forma y atrapado en el lumen del RE. Después de colorante de carga, las células se analizaron en un microscopio de barrido láser confocal invertido. Las células se sometieron a perfusión continua con soluciones de Ringer-como y la dinámica del calcio ER son directamente visualizada por time-lapse. La liberación de calcio desde el RE se identifica por una disminución en la intensidad de fluorescencia en las regiones de interés, mientras que la recarga de la tienda de calcio ER produce un aumento en la intensidad de fluorescencia. Por último, el cambio en la intensidad de fluorescencia con el tiempo se determina mediante el cálculo de Delta F / F _0.

Introducción

Con el fin de resolver las respuestas fisiológicas del calcio ER, hemos desarrollado una nueva estrategia para mejorar la captura de tintes sensibles calcio sintéticos en la sala de emergencias. El método permite la monitorización en tiempo real, directa, sin interrupciones del libre ER calcio en presencia de calcio extracelular.

Función y señalización de calcio ER

Señales de calcio se encuentran en diferentes tipos de células, por ejemplo células de músculo, neuronas y células gliales y su gama de funciones de la mediación de la contracción del músculo a una participación en la transmisión sináptica en el aprendizaje y la memoria ^1,2. Los cambios en la concentración de calcio libre son de alto interés científico porque el calcio está implicado en la regulación de la transcripción de genes, la proliferación celular, la excitabilidad neuronal, muerte celular y otros eventos de señalización celular ^1-7. Todas estas señales de calcio celulares están funcionalmente conectados y contribuyen a intracelular de calciotienda ^8-10 dinámica.

Una característica común entre todas las señales de calcio es el flujo de calcio entre el espacio extracelular, el citosol y los orgánulos, principalmente la sala de emergencia y las mitocondrias. Esto hace que los cambios dinámicos en la concentración de calcio dentro de estos orgánulos, los cuales son percibidos por los diferentes componentes de señalización. En general, la concentración de calcio en los rangos de ER entre 100 a 800 mM, en el citosol de la concentración de calcio es cerca de 100 nM, y en el espacio extracelular, la concentración es de alrededor de 1-2 mM. En consecuencia, hay una fuerza motriz química alta para el flujo de calcio hacia el citosol ^2,9,10.

Las señales de calcio derivados del ER más comúnmente investigados dependen de la estimulación de receptores acoplados a proteína G (GPCR), que a continuación, activan la fosfolipasa C (PLC). PLC a su vez produce inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ ^1. Tras la unión de _IP3 a su receptor _(IP-3 Rec., Figura 1) en el ER-membrana, los iones de calcio son liberados desde el lumen del retículo endoplasmático. Históricamente, la liberación de calcio mediada por IP ₃ de la ER fue el primero - aunque indirectamente - medido en células pancreáticas acinares por Streb et al en 1983 ^11.. Esta publicación sugirió por primera vez una cascada de señalización que implica la acetilcolina, la fosfolipasa C, y IP _3. Esta forma de liberación de calcio se denomina generalmente la liberación de calcio inducida por _3-IP (TIIE) (Figura 1). La activación de la quinasa dependiente de fosfolipasa Cγ por receptores tirosina quinasas vincula la acción de factores de crecimiento y factores neurotróficos para ER señalización de calcio después de _IP3 elevación ^12. Además de TIIE, elevación de calcio puede ser mediada por la entrada de calcio ionotrópicos, por ejemplo a través de los canales de calcio dependientes de voltaje (CA _V), y la posterior liberación de calcio inducida por calcio (CICR) por rianodina receptores (RyR). TIIE y el CICR están fisiológicamente vinculados a la entrada de calcio tienda que funciona (SOCE). SOCE incluye la acción de STIM (molécula interactuante estroma), que es un sensor para la liberación de calcio ER. STIM se ha demostrado que estimula la entrada de calcio extracelular a través de canales receptores de potencial transitorio (TRP) ^13, Orai canales de calcio y hasta ¹⁴ canales de calcio dependientes del voltaje ¹⁵ (Figura 1). La pérdida de calcio ER es rescatado dinámicamente por la acción del retículo endoplásmico sarco-ATPasa de calcio (SERCA), que activa las bombas de calcio de nuevo en la sala de emergencias. El bloqueo de la SERCA con fármacos tales como tapsigargina presenta una pérdida continua de calcio ER para el compartimiento citosólico. Esta ER calcio "fuga" es causado por ER complejos de poro intramembrane tales como el complejo de proteína Sec61 ^16,17 (Figura 1).

En 1998, Berridge publicó un modelo, la "neurona dentro de un modelo de neurona", which sugiere un papel fisiológico principio de la ER en la integración de calcio neuronal ^5. Este modelo considera la existencia de un sistema de membrana del RE continua que forma una "imagen" intracelular de la membrana plasmática neuronal ^5. Este sistema de membranas eucariotas binario se afirma que es un requisito básico para la integración temporal y espacial de las señales de calcio rápidos y lentos en las neuronas. Señales de calcio que se producen ya sea concomitantemente o posteriormente en diferentes espinas o dendritas de la misma neurona se confieren al soma o núcleo a través de la sala de emergencias, en el que se resumen ^5,18 de la célula. Entonces, su suma puede tener efectos sobre la excitabilidad de la neurona, la regulación de la transcripción de genes o la integración de cascadas de señalización. Por lo tanto, la sala de emergencias apoya la integración de las señales de calcio. Un requisito previo para este concepto es la continuidad de la ER en una sola célula, que ha sido reclamada por varios estudios y que se ha demostrado al menos para somato-dáreas endritic y corta distancia proyecciones axonales ^19-21. Si hay continuidad ER dentro de proyecciones axonales largas es una cuestión de debate.

Estrategias para medir el flujo de calcio libre sobre la membrana ER

Señales de calcio se controlan con mayor frecuencia en el citosol ^22,23. Por lo tanto, no puede ser distinguido fácilmente si Ca ^{2 +} está fluyendo hacia el citosol a partir extracelular o intracelular de las tiendas ^6,24. Para superar esta limitación, se han desarrollado estrategias metodológicas para la obtención de imágenes directas de calcio ER. En resumen, se utilizan las siguientes estrategias: (1) ER-dirigidos ingeniería genética de proteínas indicadores ^25-27 de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores basados ​​en la proteína utilizan la proteína aequorina bioluminiscente o GFP en combinación con una proteína de detección. Calcio. Estos Ca ^{2 +} indicadores de ingeniería genética (Gecis) puedeser dirigidos a la sala de emergencia con la ayuda de un péptido señal y se mantienen activamente en el ER mediante un motivo de retención y recuperación. Común ER Ca ^{2 +} indicadores de base en el principio de Cameleon y son el Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon división YC7.3ER ²⁹ y Cameleon D1 ^30. (2) Directo carga de colorante a base de esterasa AM-éster de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores. ^31,32 de los colorantes indicadores (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivados AM pasar el membranas biológicas en un estado lipofílica, calcio y minúsculas. Entonces, en el citosol, así como en la sala de emergencias, esterasas endógenas escindir el grupo de AM-éster y liberan el indicador de Ca ^{2 +,} dejando tras de sí una cierta cantidad de colorante activo en el citosol y en la sala de emergencias. Por lo tanto, este enfoque es útil en condiciones de una alta concentración de calcio en la sala de emergencias, siempre y cuando la concentración de calcio citosólico se mantiene muy por debajo de la delímite de protección de los indicadores de baja afinidad, en particular durante las señales de calcio características (por ejemplo nM a mM bajas). (3) de carga AM-éster en combinación con permeabilización de la membrana plasmática ^32. Cualquier ⁺ indicador restante citosólica de Ca ² se elimina mediante permeabilización de la membrana de plasma con pequeñas cantidades de un detergente "suave" (por ejemplo, saponina) en un tampón intracelular artificial. Por lo tanto, las membranas intracelulares pueden ser estimuladas, por ejemplo, con IP ₃ en el tampón intracelular, directamente a través de "poros" en la membrana plasmática. (4) Diálisis del citosol bajo configuración de célula y las mediciones simultáneas de Ca ^{2 +} en el lumen del RE y el citosol ^32,33. Una celda se carga por primera vez con una baja afinidad Ca ^{2 +} indicador (por ejemplo, Mag-Fura2- AM, radiométrico, la luz ultravioleta). Después, con la ayuda de una pipeta de parche, cualquier cyt restanteCa ⁺ Indicador de baja afinidad ² osolic se dializa fuera del citosol con un tampón que contiene un indicador de Ca ^{2 +} de alta afinidad (por ejemplo, Fluo-3, la luz visible). Esta estrategia permite la grabación simultánea de señales derivadas citosólicas y ER. (5) Targeted-esterasa inducida colorante de carga ^8,34. Un carboxilesterasa (CES) se dirige al lumen del ER y proporciona una alta actividad de esterasa para la captura eficiente de la forma de AM-éster de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores.

Inducida Targeted-esterasa colorante de carga (TED)

Para mejorar la focalización de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores a la luz del RE, TED se ha desarrollado. TED requiere la sobreexpresión de una carboxilesterasa ER dirigido ratón (CES2) (Figura 2), que se consigue a través de construcciones de expresión. Las células que expresan un CES-constructo recombinante se incuban con la forma de AM-éster de un calcio enindicador colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). A continuación, en la sala de emergencias, el colorante se convierte en el Ca ^{2 +} sensibles, membrana impermeable Ca ^{2 +} complejo indicador (Fluo5N/Ca ^{2 +)} por la alta actividad de esterasa, por lo tanto atrapando el colorante en una alta concentración en el lumen del RE ^{8 , 34.} El método es especialmente útil para investigar-ER liberación de calcio a través de las vías de TIIE-por ejemplo a través de metabotrópicos purinérgicos-o receptores de glutamato, ^8,34 y para visualizar el agotamiento de calcio ER a través de "canales de fugas" directamente, por ejemplo, después del bloqueo de la SERCA ^{17 , 34.} Para nuestra experiencia, la baja afinidad de Ca ^{2 +} indicador Fluo5N-AM es actualmente el mejor indicador disponible para su uso con la estrategia de carga TED tinte. Fluo5N-AM tiene una baja afinidad por Ca ^{2 +} (constante de disociación K _D ~ 90 mM, Figura 2), es casi no fluorescente en su AM-forma, pero ofrece una alta emisión de fluorescencia a calciu^8,34 m vinculante. El Fluo5N/Ca ^{2 +} complejo puede ser excitado con una fuente de luz estándar de ~ 490 nm, que corresponde a los tintes estándar tales como FITC, Alexa 488, o eGFP. Señales de calcio citosólico apenas alcanzan una concentración en el rango de baja mu M y por lo tanto apenas se detectaron por Fluo5N en el citosol ^35.

Para mejorar el funcionamiento del TED, se han desarrollado varias construcciones de vectores recombinantes (Figura 3). Originalmente, los vectores de TED basado en la secuencia de codificación de CES2 (Refseq número de acceso NM_145603, CES2c) y mejor funcionamiento del TED se observa con expresión estable de construcciones de CES. Nuevos vectores TED expresan un elemento central de CES2 fusionado a la proteína roja fluorescente TagRFP-T2 ^36. Estos vectores tienen la ventaja de que pueden ser utilizados para identificar las células transducidas y para utilizar la fluorescencia roja como un control interno para la normalización de los cambios en Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescencia. La fluorescencia de color rojo también ofrece la posibilidad de visualizar la distribución estructural de la sala de emergencia y los cambios en la dinámica de ER en condiciones de estimulación.

Protocolo

Este protocolo introduce TED aplica a líneas de células, neuronas del hipocampo y células gliales corticales. TED rendimiento es mejor cuando los vectores TED se expresa de forma estable, por ejemplo por medio de vectores lentivirales. Una visión general esquemática del método de TED se muestra en la Figura 4.

1. Preparación de las soluciones

Las siguientes soluciones deben estar preparados antes de comenzar y pueden ser almacenados como se indica. Utilizamos generalmente de vidrio esterilizado y el material plástico y el agua tratada en autoclave.

1. Prepare HEPES-Ringer (en mM): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 _MgSO4 0,7 H ₂ O, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O.. Calcio sin HEPES-Ringer consiste (en mM): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 _MgSO4 0,7 H ₂ O, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O y 0,1 EGTA.. Sin glucosa estas soluciones de imagen puede be almacenadas a 4 ° C. La cantidad requerida de D-glucosa está recién añadido antes de su uso.
2. Para el análisis de TED en las neuronas del hipocampo, se recomienda fluido cerebroespinal artificial (ACSF). ACSF se compone de (en mM): 127 NaCl, 23 NaHCO _3, 3 KCl, 2,5 _NaHPO4 H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O, 2 de CaCl _2, MgCl 2 ₂ 0,7 H ₂ 0 en ddH. ₂ 0.
3. Preparar Fluo5N-AM a una concentración de 5 mM. Para ayudar a la solubilización añadir 8,9 l de 20% de Pluronic F-127 (en DMSO, almacenada a temperatura ambiente, protegido de la humedad y la luz) a 50 g de liofilizado Fluo5N-AM. Entonces solubilizar Fluo5N-AM por medio de un aparato de ultrasonidos en baño de agua durante al menos 2 min. Tienda alícuotas a 0,5 l a -20 ° C, protegido de la luz y la humedad.
4. Prepare antagonistas y agonistas de stocks según sea necesario. Por ejemplo: a) 10 mM ATP o ADP (en H ₂ O, la activación de los receptores metabotrópicos purinergic), b) 10 mM carbachol en H ₂ O (agonistareceptor muscarínico de acetilcolina), c) 30 mM de ácido ciclopiazónico (CPA) en DMSO (bloqueador de la SERCA), d) DHPG 50 mM en PBS (agonista del receptor metabotrópico de glutamato para mGluR _I y mGluR _5), e) Glutamato 10 mM en H ₂ O, f) ionomicina 1 mM en DMSO (ionóforo), g) tapsigargina 5 mM en DMSO (bloqueador de alta afinidad de la SERCA). Tienda alícuotas a -20 ° C.
5. Los vectores lentivirales: Este protocolo incluye el uso de la expresión partículas de vector lentiviral TED. Su producción y almacenamiento no es parte de este protocolo. Utilizamos vectores lentivirales de la segunda generación para la transferencia de carboxilesterasas recombinantes a líneas celulares, células gliales y las neuronas. Nuestras bases del sistema lentiviral en el vector de expresión FUGW ^37, y los plásmidos de encapsidación pCMVΔR8.91 o psPAX2 y el plásmido pMD2.G ^38,39 pseudotipado PRECAUCIÓN:. Considere que el trabajo con vectores lentivirales recombinantes de auto-inactivación requiere el cuidadoconsideración de normas de bioseguridad. En muchos países, estos vectores se clasifican como grupo de riesgo de riesgo biológico 2. Para obtener más información, consulte http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. La preparación y la infección viral del ratón neuronas del hipocampo

1. Lavar cubreobjetos de vidrio en una placa de Petri de vidrio de 20 cm de diámetro (100 cubreobjetos por plato) 1x en 70% de etanol durante aproximadamente 30 min. Por último, añadir etanol al 100% (anual) durante 2 min. Eliminar el etanol residual y secar los cubreobjetos bajo una campana estéril.
2. Prepare dos tipos diferentes de medios de cultivos de neuronas del hipocampo: (a) medios neurobasal con B27 01:50, (b) medio lleno: medio neurobasal con B27 01:50, Glutamax 1:100 y 1:100 N2 suplemento. Estéril filtrado los medios de comunicación y los almacena en el incubador de células hasta su uso.
3. Un día antes de la disección, los cubreobjetos se preparan mediante la colocación de una primera estéril mm cubreobjetos 10 en cada unobien de un 4-así placa de cultivo celular. Posteriormente, la capa cuidadosamente cada cubreobjetos con 80-100 l 0,1% de poli-L-lisina y almacenar los platos en una incubadora durante la noche.
4. En el día de la disección y cultivo de células, comenzar con el lavado de los cubreobjetos tres veces con 100 l de HBSS y transferir 100 neurobasal medio l a cada cubreobjetos. Colocar las cápsulas en una incubadora para el equilibrio (por ejemplo, durante la disección de los ratones).

Disección

Llevamos a cabo nuestros experimentos con ratones, de acuerdo con las directrices de la Unión Europea, aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el comité de utilización.

5. Retire el cerebro total y diseccionar el hipocampo bilateral.
6. Retire con cuidado las meninges y el tejido que no sea el hipocampo y coloque un hipocampo cada una en un tubo de 1,5 ml que contiene 450 l HBSS. Almacenar el tejido en hielo hasta que se ha aislado un número suficiente de hipocampos.

Cultivo de células

7. Añadir 50 l 1% de tripsina (Worthington) a cada tubo y se incuba en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min. Agitar los tubos de vez en cuando. Para detener la reacción de digestión, se añaden 50 l de inhibidor de tripsina al 1% a cada tubo y se invierte el tubo varias veces.
8. Transferir todo el tejido de hasta 5 hipocampos a uno 15 ml tubo Falcon evitando la transferencia de líquido. Añadir B27-medio (a) a un volumen final de 5 ml.
9. Se tritura el tejido usando un incendio Pasteur pulida pipeta de vidrio con cuidado pipeteando arriba y abajo PRECAUCIÓN:. Evitar las burbujas de aire!
10. Girar con 400 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 5 ml de medio B27-(a).
11. Se tritura el tejido una vez más con la pipeta de vidrio, y luego dos veces con la ayuda de una punta de l filtro de plástico 1000. Realice este como se describe en los pasos 2,9 y 2,10.
12. Después de la última centrifugación, resuspender el botón celular en 2 ml llena medium (b) y triturar las células con una punta de l filtro de plástico 200. Para separar los restantes grupos de células de la suspensión de células individuales, permiten grupos de células se establecen durante 1-2 min.
13. Contar las células y calcular el número total de células necesarias para la infección viral. Por TED imágenes utilizan 25.000 células por 10 mm cubreobjetos.
14. Blindaje de 25.000 células no transducidas adicionales como un control se recomienda en este punto.

Infección viral

15. Transferir la suspensión de células para la infección viral en un nuevo tubo Falcon de 15 ml y centrifugar durante 3 min a 400 x g.
16. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 300 l de medio (b)
17. Añadir una cantidad adecuada de expresión lentiviral partículas infecciosas TED vectoriales y deje que el tubo Falcon reposar a temperatura ambiente durante 10 min.
18. Llenar el tubo con medio completo (b) al volumen final necesario para el chapado (100 l por cada 10 mm cubreobjetos), aspirar el medio de la coberturaerslip, e inmediatamente colocar 100 l de suspensión celular en cada portaobjetos.
19. Colocar las cápsulas en la incubadora hasta que todas las células se han establecido (aprox. 2 horas) y rellenar cuidadosamente los platos hasta que contienen 2 ml de medio (b).
20. Deje que las neuronas crecen durante al menos una semana. Reemplazar 50% del medio de cada semana.

3. Cultura y viral de la infección del ratón corticales células gliales

Preparación

1. Comience por la preparación de medio basal de células gliales (mezcla 1:1 de medio DMEM/F12 con 10% de FCS, HS al 5%, 1% de penicilina / estreptomicina, 0,45% de glucosa) y revestimiento de un matraz de cultivo de células T75 con 4 ml de 0,5 ng / ml de poli -DL-ornitina bromhidrato de (PORN) (diluido en solución de ácido bórico 150 mM, pH 8,35). Después de la incubación a 37 ° C durante 2 horas o durante la noche, lavar el matraz de cultivo de células tres veces con HBSS y añadir 18 ml de medio basal de células gliales que contiene B27 1:50 y 10 ng / ml de EGF. Equilibrar el recipiente de cultivo celular en la incubadora (hasta 3 horas).

Dissection

1. Llevamos a cabo nuestros experimentos con ratones, de acuerdo con las directrices de la Unión Europea, aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el comité de utilización.
2. Diseccionar el cerebro de uno P5-P7 ratón y eliminar el hipocampo y las meninges de ambos hemisferios como se describe en 2.5.
3. Diseccionar el córtex frontal, cortarla en varios trozos pequeños y recogerlas en un tubo de 1,5 ml que contiene HBSS. Guarde el tubo en hielo y pasar a la parte de cultivo celular.

Cultivo de células

4. Transferir todo el tejido desde el tubo a un tubo Falcon de 15 ml usando una pipeta de vidrio pulida fuego.
5. Añadir medio basal a un volumen final de 5 ml y se tritura el tejido con la pipeta varias veces arriba y abajo con una pipeta de vidrio pulida fuego. Después de centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el medio, y resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio basal.
6. Repita el paso 3.5 veces.
7. Después de la thiª centrifugación, resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio basal de células gliales que contiene B27 (01:50) y 10 ng / ml de EGF.
8. Titruate una vez más y transferir la suspensión de células en el matraz de cultivo de células T75 preparado y dejar que las células crezcan durante 3-4 días.

El lavado de las células gliales (después de 3-4 días de cultivo):

9. Lave las células una vez con 10 ml de PBS y toque vigoroso o golpear suavemente el frasco varias veces con la mano, mientras lo mantiene firmemente en la otra mano. Por este paso y los restos celulares se eliminan grupos de células a partir del cultivo.
10. Aspirar el PBS y añadir medio fresco que contiene glía basal B27 (01:50) y 10 ng / ml de EGF. Seguir fomentando la cultura durante 5-7 días hasta que las células alcanzan el 80% de confluencia.

La división, la transducción y la siembra final de células gliales:

11. Escudo cubreobjetos de 10 mm con 100 l de poli-D-lisina (solución madre: 0,1%, se diluyeron 1/50 ad 20 g / ml en PBS o HBSS) y se incubaen una incubadora durante la noche. Lave cubreobjetos tres veces con HBSS y se añaden 100 glia medio basal l. Equilibre cubreobjetos en la incubadora (3 h).
12. Lavar las células gliales dos veces con 10 ml de PBS, aspirar el PBS y añadir 3 ml de tripsina (TrypLE, sin diluir). Tripsinizar células con capacidad para 1 min PRECAUCIÓN:. Evitar el exceso de tratamiento con tripsina. Normalmente, más de 80% de todas las células se desprenden después de 1 min y esto es suficiente para tener varios millones de células sanas.
13. Se detiene la reacción mediante la adición de 10 ml de medio basal de células gliales, transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml Falcon, centrifugar a 300 xg durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio basal de células gliales.
14. Una vez más, con buenos efectos y aspirar como se describe en el paso 3.15, a continuación, volver a suspender las células en 5 ml de medio Glia basal.
15. Transfiera el número necesario de células a un tubo de 1,5 ml. 10 ^{4-2x10 4} células gliales son suficientes para un cubreobjetos de 10 mm. Por lo general, la suspensión volUME para transducir células para una 4-bien plato es menos de 200 l. Añadir una cantidad apropiada de partículas de vector de expresión lentiviral TED a las células e incubar ellos a TA durante 10 min. Luego llene la suspensión con medio basal glia al volumen de siembra (100 l por cubreobjetos).
16. Semilla 100 l de las células infectadas por cubreobjetos y se incuba durante aproximadamente 2 horas, después se añade medio de glía basal conteniendo B27 1:50 y 10 ng / ml de EGF a un volumen final de 2 ml.
17. En condiciones de cultivo ideales utilizar células para los experimentos en 3-7 días después de la siembra.

4. Generación y Cultura de reportero línea celular

Se establecieron líneas celulares TED reportero sobre la base de HeLa, BHK21, HEK293 y SH-SY5Y. Aquí le proporcionamos el protocolo para las células HeLa, pero el protocolo se puede transferir a cualquier otra línea celular también.

Generación de línea celular HeLa estable

1. Dividir una línea celular HeLa tipo salvaje y la transferencia de 100 000 cells en un volumen de 200 l a un tubo de 1,5 ml.
2. Añadir una cantidad apropiada de partículas de vector de expresión lentiviral TED al tubo y se incuba la suspensión de células-virus durante 10 min a TA. A continuación, semillas de las células en un volumen total de 2 ml de medio (DMEM, 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina) en una placa de 30 mm y se incuba durante 3 días.
3. Después de lavar una vez con PBS, aspirar el medio y añadir 500 l de tripsina (TrypLE, 2:03 en PBS). Incubar durante aprox. 3 min y luego se detiene la reacción mediante la adición de 3 ml de medio. Transferir la suspensión en un tubo de ml y centrifugar Falcon de 15 a 400 xg durante 3 min.
4. Resuspender el sedimento celular en 200 l de medio y otra vez infectar las células con partículas lentivirales tal como se describe en 4.2. Luego, las células de semillas en un frasco de cultivo de células T25 en 10 ml de medio.
5. Se cultivan las células hasta una confluencia del 60-80% que se alcanza. Luego divida la cultura.

TED líneas celulares reportero

6. TED líneas celulares indicadoras se pueden mantenered en cualquier medio estándar, por ejemplo, DMEM que contenía 5% o 10% de FCS y 1% de penicilina / estreptomicina se utiliza.
7. Placa de un número apropiado de células en una placa de 4 pocillos que contiene cubreobjetos estériles de 10 mm (véase más arriba), por ejemplo, 10.000 a 20.000 células por cubreobjetos.
8. Se cultivan las células durante al menos dos días antes de usarlos para TED formación de imágenes.

5. Preparación para el procedimiento de imagen en vivo en un microscopio invertido

1. 1. Precaliente HEPES-Ringer a temperatura ambiente y añadir D-glucosa.
   2. Precalentar el ACSF (sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} a temperatura ambiente y añadir D-glucosa. Ventile la ACSF con carbógeno durante 5 minutos. A continuación, añadir 1 soluciones madre M de _CaCl2 y _MgCl2 a la concentración final de 2 mM de cada uno.
2. Inicie los microscopios de imágenes en directo y todos los programas de ordenador.
3. Iniciar la perfusión en una cámara de imágenes "ficticio" y equilibrar el sistema de tubos.
4. Calentar inicialmente el calentador de solución en línea y la cámara de imágenes en la platina del microscopio. Fijar la cámara de imágenes en un inserto de calefacción.
5. Equilibre el sistema a 32-37 ° C antes de iniciar el procedimiento de carga de colorante PRECAUCIÓN:. Para evitar el flujo accidental de la solución de perfusión en el sistema de microscopio usamos cintas para el pelo alrededor de los objetivos y las hojas de silicona elastómero (1 mm) para proteger la platina del microscopio.

6. Colorante de carga de cualquier tipo de célula

1. Resuspender 1 alícuota de Fluo5N-AM (ver 1.3) en 100 l solución de imágenes precalentado (HEPES-Ringer o ACSF).
2. Solubilizar Fluo5N-AM en la solución de imagen (HEPES-Ringer o ACSF) en un baño de ultrasonidos baño de agua durante 90 segundos.
3. Utilice un nuevo máximo de 4 - o 400 l solución de imágenes precalentado de 24 pocillos y traslado a un pozo. Añadir la solución de tinte a la misma bien para llegar a 500 l de una solución 5 mM.
4. Colocar con cuidado un cubreobjetos con las células (por ejemplo,10 a 18 mm de diámetro) en el pozo, las células hacia arriba.
5. Se incuba durante un período adecuado de tiempo en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C (Mientras tanto preparar la configuración de imagen en la platina del microscopio). Tiempos de tinte de carga típicos son para las neuronas y las células gliales 7-15 min y para líneas celulares 10-20 min.

Cruciales: tiempo de tinte de carga y concentración de colorante dependen del tipo de células, la densidad celular, y las necesidades específicas del experimento! Los largos tiempos de incubación en presencia del colorante pueden dañar las células, especialmente las neuronas primarias y células gliales primarios y esto es fundamental para la capacidad de respuesta a los estímulos fisiológicos. Tiempos de incubación largo (por ejemplo, 30 minutos) sólo serán útiles para ER experimentos de localización de calcio para investigar la distribución de calcio ER en pequeñas estructuras subcelulares, por ejemplo, neuritas finas o espinas. En algunos experimentos, una mezcla de 1/3 medio de crecimiento con una solución de formación de imágenes puede ayudar a proteger a las células durante Fluo5N-AMcarga.

6. Al instante, transferir el cubreobjetos a otro pocillo de cultivo celular que contiene solución de imágenes (HEPES-Ringer o ACSF) y empezar a montar las células en la cámara de formación de imágenes.

7. ER-calcio imágenes de células vivas con un láser invertido microscopio confocal de barrido

1. Use un pincel para aplicar grasa de alto vacío a una cámara de imágenes. La grasa es necesaria para fijar el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara de perfusión. Utilizamos cámaras de formación de imágenes hecho a sí mismo durante 10-12 mm cubreobjetos con un pequeño volumen, lo que permite altas velocidades de perfusión de hasta el intercambio de tampón 15 veces por minuto. Una cámara de perfusión disponibles comercialmente para cubreobjetos de 18 mm, puede ser comprado de Warner instrumentos (RC-49FS). Esta cámara también permite la estimulación del campo de las neuronas.
2. Recoger el cubreobjetos con las células Fluo5N-cargados y añadir una pequeña gota de solución de imágenes (50-100 l) en las células para mantener las células cubiertas con solución de imágenes.Girar el cubreobjetos al revés y montar las células en la cámara de formación de imágenes. Para presionar el cubreobjetos en el silicio-cola, utilice un bastoncillo de algodón (por ejemplo, Q-tips).
3. Limpie el tampón residual de la parte inferior del cubreobjetos con bastoncillos de algodón PRECAUCIÓN:. Limpie cuidadosamente la humedad residual cuando se utiliza un objetivo-aceite con alta apertura numérica para obtener imágenes de alta resolución. Sal residual se elimina mejor por el agua. Frotis Accidental de grasa se puede quitar con acetona o etanol puro.
4. Cambio de la cámara de imágenes "ficticio" con la cámara de imágenes experimental. Lavar las células durante 5-10 min por perfusión continua.
5. Lavar las células durante 5 - 10 min por perfusión continua.
6. Para la selección de células utilizar una cantidad mínima de iluminación láser, las altas tasas de exploración (2-4 Hz), un pequeño tamaño de la imagen, y una ganancia alta.
7. PRECAUCIÓN: Para la selección de las células Fluo5N marcados no utilice más de iluminación de luz directa o con epifluorescenluz t. Brillante iluminación de Fluo5N/Ca ^{2 +} complejos produce la pérdida completa de la fluorescencia ER-específica dentro de 2-4 segundos (Figura 5).
8. Configure el microscopio según el experimento planeado. Para la orientación, parámetros representativos para la formación de imágenes con diferentes vectores de TED se dan en la Tabla 1. Para la microscopía confocal de barrido láser invertida, usamos un microscopio Olympus IX81 combinado con un sistema confocal 1000 Fluoview que está equipado con láseres de diodo (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) y un sistema detector espectral.
9. Al principio del documento experimento las células de interés de alta resolución x, yz pilas de imágenes.
10. Realizar x, yt formación de imágenes para controlar la dinámica del calcio ER en las condiciones experimentales específicas. La configuración típica para nuestro sistema se listan en la Tabla 2.
11. Monitorear los cambios en el calcio ER bajo perfusión continua con una solución de formación de imágenes. Las tasas de intercambio de tampón típicos son el correoxemplarily: (a) lavado de las células y la tienda de agotamiento por el bloque SERCA: 1,5 ml / min; (b) ATP / DHPG estimulación: 3 ml / min.
12. Adquirir imágenes digitales preferentemente con 12 bits (4096 valores de gris). Para imágenes en paralelo de Fluo5N/Ca ^{2 +} y RFP, imágenes de 8 bits (256 niveles de gris) puede recuperar el sistema de desbordamiento de datos.
13. Guarde las imágenes en directo de células de series de tiempo (x, yt) o pilas de imágenes 3D (x, yz) (para la distribución celular de Fluo5N/Ca ^{2 +} complejos) en un formato compatible ImageJ (por ejemplo, TIFF).

8. Procesamiento de imágenes y análisis de datos

1. Abra la imagen de pila en el programa ImageJ. En caso de multicolor de imágenes, dividir los canales RGB cuando se le preguntó por ImageJ.
2. Identifique su zona (s) de interés (ROI) de un examen cuidadoso de las pilas de imágenes (por ejemplo, con ayuda de una intensidad frente a tiempo parcela)
3. Utilice el complemento Analizador de series de tiempo para leer la intensidad media de píxeles en un retorno de la inversión (F _crudo). Depending adrede, dibujar regiones de interés en torno a la sala de emergencia ya sea completa o pequeñas regiones del ER ER por ejemplo de las dendritas de las regiones periféricas de células. También incluya 1-3 ROI en zonas sin células para la sustracción de fondo.
4. Calcular la media de fluorescencia de fondo (F _b) mediante el cálculo del valor de fluorescencia media del ROI de fondo y resta el valor de fondo F _b de los valores _brutos F para obtener el valor _roi F.
5. Calcular F _0, que es la fluorescencia basal de las células, mediante el cálculo del valor medio de diez a 30 valores fluorescentes para cada retorno de la inversión en un estado de reposo.
6. Calcular los cambios relativos de fondo corregidos en la fluorescencia de Df / F ₀ por la fórmula:

7. Cambios relativos presentes en fluorescenciana vez como una traza con Delta F / F ₀ para el eje Y y el tiempo para el eje X.

Resultados

Este protocolo proporciona un enfoque no-perjudicial para la imagen directa de la libre ER calcio. De baja afinidad sintética Ca ^{2 +} indicadores son liberados y atrapados en el lumen del RE con la ayuda de un ER específica, actividad de la enzima esterasa recombinante. Mejora de la carga de la Ca ^{2 +} indicador tintes para el ER lumen permite una imagen directa y rápida de la dinámica de la tienda calcio ER.

Tipos de células de TED

La viabilidad...

Discusión

Las ventajas y desventajas del método TED se han discutido ampliamente en publicaciones recientes ^34,35. En comparación con otros métodos descritos anteriormente, el TED evita el problema de la interrupción y la perfusión de las células. Por otra parte, dos aspectos deben ser enfatizado. El principio de TED para ER imágenes de calcio requiere de (1.) La expresión selectiva de una carboxilesterasa activo en el lumen del retículo endoplasmático con la ayuda de TED constructos vectoriales y (2.) La liberación ef...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
(S)-3,5-DHPG (Dihidroxifenilglicina)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, hidrato de sal disódica ATP	Sigma	A26209-1G
B-27 suplemento,50x	Invitrogen	17504-044
Cloruro de carbamoilcolina (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Ácido ciclopiazónico (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM con Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
PBS de Dulbecco sin Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Suero fetal para terneros	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ g	Invitrogen	F14204
Glutamato	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Mezcla de nutrientes Ham's F12	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) sin Ca, sin Mg, con Rojo de Fenol, HBSS	Laboratorios PAA	H15-010
Suero de caballo	SHD3250YK	Linearis
Ionomicina Ca2+ sal	Ascent scientific	Asc-116
murino EGF	PreproTech	315-09
N2 suplemento 100x	Invitrogen	17502-048
Medio neurobasal	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, baja absorbancia UV,2g	Invitrogen	P6867
Hidrobromuro de poli-DL-ornitina PORN	Sigma	P8638
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma	P7280
Poly-L-lisina	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Tripsina	Worthington	LS-003707
Inhibidor de tripsina de glicina MAX (soja)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: microscopio de barrido láser invertido: FV1000 con IX81	Olympus		configuración específica para el usuario
Sistema confocal: combinador láser FV10 y láseres de diodo (405, 473, 559, 635)	Olympus		configuración específica del usuario
Sistema confocal: cabezal de escaneo FV10-SPD con detector espectral	Configuración específica del usuario de	Olympus
Controlador de calefacción TC-344B	Warner Instruments	64-0101	para controlar el calentador de solución en línea
Software	NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objetivo: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objetivo: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objetivo: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Cámara de perfusión, inversa	hecha
Cámara de perfusión, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Tubo de perfusión: PT-49	Warner Instruments	64-1730	para perfusión
Bomba peristáltica MiniPlus 3 (4 canales)	Gilson	n.a.bomba	perfusión
Calentador de solución en línea simple SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlado por el controlador del calentador
Tubos de aspiración: ST3R	Warner Instruments	64-1407	para perfusión
Inserto calefactor: Tempocontrol 37-2 digital 2 canales	Pecon	n.a.