El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo In vivo Pulmón de ratón.
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Artículo de método
Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial
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Resumen
Resumen
El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.
Introducción
El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido 1, neutrófilos endotelial adhesión 2, y 3 de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante.
Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de 4, 5 y su degradación durante la fijación del tejido estándar ....
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Protocolo
1. Preparación de tubos quirúrgicos, catéteres vasculares, Ventana pared torácica
- Etapa microscopía intravital. Hemos hecho a medida de una etapa de plexiglás sobre la que se encuentra el ratón anestesiado durante la microscopía. Esta etapa se adapta tanto a un 15 cm por 10 cm flexible, tabla de cortar de plástico (en la que el ratón se encuentra durante la inducción de la anestesia, la colocación de traqueotomía, y el cateterismo venoso), así como un elemento de calentamiento de tamaño similar (situado debajo de la tabla de cortar).
- Ratón toracostomía preparación del tubo (Figura 1). Una longitud de 10 cm de tub....
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Resultados
El método experimental descrito en los pasos 1-6 se permitir la captura de fotogramas múltiples de DIC simultánea (claro) y las imágenes fluorescentes. Para determinar el espesor ESL, las imágenes grabadas se revisan por un observador ciego después de la finalización del protocolo experimental. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (<20 m de diámetro) se identifican, por lo menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo cuadro (Figura 10). El uso de software de análisis de imá.......
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Discusión
Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco.
Varios avances técnicos re.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos a los Dres. Arata Tabuchi y Wolfgang Kuebler (Universidad de Toronto) para la instrucción con respecto a la microscopía intravital. Damos las gracias a Andrew Cahill (Nikon Instruments) para la asistencia en el diseño e implementación de microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH / NHLBI subvenciones P30 HL101295 y K08 HL105538 (a EPS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de Reactivo | |||
| FITC-dextrano (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextrano (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Recubiertas de estreptavidina microesferas fluorescentes | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragón verde fluorescente (similar a FITC) |
| La ketamina | Moore Medical | ||
| Xilazina | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 anticuerpo biotinilado | eBioscience | Clonar YN1/1.7.4 | Dilución 1:50 |
| Isotipo de anticuerpo biotinilado | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | Dilución 1:50 |
| EQUIPO | |||
| Ventilador mecánico | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Traqueostomía catéter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Aparato de electrocauterización | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Cauterio bipolar fórceps | Olsen Medical | 10-1200i | 9.9cm McPherson |
| Temperatura control sistema | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Bomba de jeringa | Harvard Apparatus | Bomba Elite 11 | |
| Microscopio (campo amplio) | Nikon | LV-150 | |
| Microscopio (confocal) | Nikon | A1R | |
| Imagen divisor | Fotometría | DV2 | |
| CCD cámara | Fotometría | CoolSNAP HQ2 | |
| Software de procesamiento de imagen | Nikon | Elementos NIS | |
| Membrana de polivinilideno | Kure Wrap | ||
| Cubreobjetos circular | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, # 1 espesor |
| Pegamento (cover slip a la membrana) | Pattex | Flüssig (líquido) | Para fijar cubreobjetos a la membrana |
| Pegamento (cubierta deslizante para el ratón) | Pattex | Gel | Para la fijación de la membrana de ratón |
| Tubo quirúrgico | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Pescador | Seda 04:00 | |
| Rasuradora eléctrica | Oster | 78997 | |
| Curvados fórceps quirúrgico | Roboz | ||
| Straight pinzas quirúrgicas | Roboz | ||
| Tijeras quirúrgicas | Roboz | ||
| Micro tijeras quirúrgicas | Roboz | ||
| Conductor aguja quirúrgica | Roboz | ||
| Cinta quirúrgica | Pescador | ||
| Esponjas de cocina (cortado en trozos) | vario |
Referencias
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al.
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Reimpresiones y permisos
