Summary
hemozoinの常磁性特性は後期を分離するために使用されている
Abstract
他の原虫種とは異なり、P.熱帯熱マラリア原虫は、その研究1を容易に実験室で培養することができる。達成寄生虫は≈40％の限界に達することができますが、治験責任医師は、通常約10％の割合を維持します。多くの場合、それが文化を豊かにし、与えられた実験を続行し、感染していないものから寄生虫含有赤血球細胞（赤血球）を単離することが必要である。
ときはP.熱帯熱マラリア原虫が赤血球に感染する寄生虫が低下し、ヘモグロビン2,3から供給されます。しかし、寄生虫は非常に有毒な鉄を含有するヘム部分4,5に対処する必要があります。寄生虫はhaemozoin 6,7と呼ばれる不活性液晶ポリマーにヘムを変換することによって、その毒性は見逃されている。この鉄含有分子は、その食胞に格納されており、その中に金属がヘム8のものと異なる酸化状態を有している。ヘム鉄の鉄状態ozoinはそれに感染していない赤血球中に存在しない常磁性を付与する。侵略の寄生虫が成熟に達すると、haemozoinの内容もPの最新のステージでさらに常磁性を授けている、9を増加赤血球内部の熱帯熱マラリア 。
この常磁性、Pの最新の段階に基づいてfalciparum感染、赤血球は、磁気ビーズを含むカラムを通して文化を通過させることによって分離することができる。それらを含む列がマグネットホルダ上に配置された場合、これらのビーズは、磁気になる。フロースルーは、ほとんどの部分、非感染赤血球および寄生虫の含有するもの初期段階のため、含まれていながら、常磁性に起因する感染した赤血球は、その後、列の中に閉じ込められます。
ここで、我々は良い寄生虫の生存率10を維持した磁気カラムを持つ後期寄生虫の人口を豊かにするための方法論を記述している。この手順を実行した後、付着していない文化が残っている寄生虫が成長し続けることができるようにインキュベーターに戻すことができます。
Protocol
プロトコルのすべてのステップは、遠心分離を除いて、サンプルを無菌に保つためにフード内に実施されるべきである。
1。 Pの後期段階の分離熱帯熱マラリア原虫感染赤血球
寄生虫で常磁性を付与hemozoinが、属に共通の代謝物であるので、マラリア原虫感染赤血球のすべての後期段階では、この方法論で区切ることができます。文化の高い寄生虫（3-10％）はこのプロトコルを使用してより良い収率を得るために推奨される、典型的な文化は2-4％のヘマトクリット（赤血球容積率）、1〜8％の寄生虫血症（感染の割合が含まれますが、赤血球）。トレガとヤンセン1で説明したように寄生虫は培養することができる。
- シンプル、マルチパートの設定はすべてのシゾント分離手順のために組み立てる必要があります。このために、LSの列、磁気MidiMACSセパレータとミルテニーバイオテク（ 図1からMACS MultiStand
- 別のチューブに（全体で50ミリリットルconicalsを使用）、RPMI1640の23.2ミリリットルと作業ソリューションを作成する7.5％の炭酸水素ナトリウム750μlを混合します。廃棄するため手で追加のチューブを持っていると寄生虫文化のフロースルー収集。
- それを平衡化するために列に作業溶液3mlを追加し、フロースルーチューブには廃棄してください。
- Pの8ミリリットルを追加列に熱帯熱マラリア原虫は、文化、できるだけ早く作業ソリューションの最後の部分として培養による列から押し出されていることを確認して、受信したチューブは、結合していない文化のリカバリを開始する収集で置き換えられます。これは、任意のさらなる文化を希釈を避けるために必要です。
- コラムを通じて文化の流れが止まった後、列の残りの赤血球を押し出すために、作業溶液1mlを加える。
- ステップを洗濯：列に作業ソリューションの別の3ミリリットルを追加し、他のチューブにフロースルーとして保存されている文化を希釈避けるために、 "廃棄"チューブに流れる液体を収集します。
- 溶出：3ミリリットルがカラムを通過した後は、スタンドから後者を切り離し、15 mlチューブの上に置きます。
- 繰り返しになりますが、列に作業溶液3mlを加える。このステップでは、列のビーズに閉じ込められた後期原虫感染赤血球を溶出する。
注：この時点で、必要に寄生虫の量に応じて、元の文化の中で寄生虫の限界に明らかに被写体コレクションの別のラウンド/ sを開始します。流れが定常状態を維持している列であれば再利用することができます。
- 収集された寄生虫の濃度：室温で150×gで5分間溶出液を含む15 mlチューブを遠心寄生された赤血球から濃いペレットを形成する。
- （以下の手順2を参照してください）非常に小さいサンプルを取り、顕微鏡を通して濃度と総収量を決定するのに十分な液体残して上清を取り除きます。
- 後期原虫の分離と回収が十分に達成されている場合は、この時点では、新鮮な培地を再び回収した培養をインキュベートする。
- その後の実験に必要なボリュームと溶液中で収集された寄生虫を希釈します。
2。純度や歩留まり解析
- 血球計数器を用いて、光学顕微鏡下でカウントした寄生虫の濃度を確認します。カウントするには、血球計数器のカバースリップの下で収集寄生虫やメディアミックスの10μlを添加する。血球計数器の4つの象限の寄生虫の数を数えて、4で合計数を割る。感染した電子の濃度を得るために、10 4によって、その数を掛けるmlあたりrythrocytes。
ノート：a）混合物の濃度が、多かれ少なかれ、培地を加えて、ペレットを再懸濁した瞬間にユーザによって決定される。作業濃度がμlあたり5.5×10 4 schizontes（これは一般的に収集された寄生虫に100から300μlを添加することによって達成される）が示唆された。この濃度の20μlをメディアや赤血球100μlのミックスの最終容量に追加された場合は、代表的な4％ヘマトクリット文化で約1％の寄生虫血が得られるであろう。 B）血球計算板の下にカウントは、赤血球がチャンバ内の試料が乾燥として溶解開始以来、迅速でなければならない。過半数であるべき感染赤血球は、非感染のものからそれらを区別するダークスポットの内側を、表示されます。
- 薄層を実行ギムザ、それらを乾燥させ、10％メタノールで非常に急速にスライドを固定することによって、コレクションの純度を評価するために染色し、tを浸漬ギムザの20％溶液で裾を蒸留水で希釈した染色。彼らは空気で乾燥した後、顕微鏡下で検査できるようになるまでの10分間、スライドを染色する。よく70％以上の寄生虫は達成可能である必要があります。
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Representative Results
図2では、磁気カラムを通過する文化が前（A）と手順（B）後、表示されます。矢印は、 図2Aの感染赤血球を指すと、 図2に示すように、1〜2感染赤血球は通常100X倍率分野で見られる。典型的な手順では、5％の寄生虫血症（ 図2A）で培養を皮切りに、この手順のパフォーマンスは、通常97パーセント-100％（ 図2B）の原虫で赤血球を生成します。 20Xのオーダーの寄生虫の濃縮が容易に達成可能であり、カラムを通して文化のいくつかのパスは、Pの高収率を達成することができる熱帯熱マラリア原虫の後期感染赤血球、必要に応じて、または所望。
図1。
図2。 A）は、代表的な5％濃縮の前に寄生虫コンテンツを同期していない。この磁気手続きを通じて収集寄生虫1μlの試料はギムザ染色し、100Xの倍率で観察した。 1〜3つの感染赤血球は、通常の範囲の任意のフィールド（矢印）が濃縮した後、B）寄生虫のコンテンツで見られている。この磁気手順を通じて、収集寄生虫1μlの試料はギムザ染色し、100Xの倍率で表示されている。寄生虫は現在99％です。
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Discussion
マラリア原虫P.の in vitro 培養における熱帯熱マラリア原虫は、より文化の最高増殖時点で感染していない赤血球の半分以下で、限られた寄生虫血症を呈する。ほとんどの研究実験のためには、感染赤血球でのみ動作することが望ましい。この目的を達成するために、分離技術は、感染によると文化を分割することが必要である。便利なメソッドは非感染赤血球11と二つのグループの異なる密度を活用微分遠心のバリエーションのシリーズを透過性とlyzeするストレプトリジンOの使用を含む。これらの方法のいくつかは、ゼラチン浮選12とPlasmion 13の使用を含め、他の赤血球をトラップするために様々な密度の層を作成するために使用される最も一般的な物質は寄生虫14にいくつかの毒性を提示することができる密度勾配媒体パーコールです。
我々はヘクタールVEでもPaulによって記述され、さらにhaemozoin、寄生虫によるヘモグロビンの消化によって産生される活性結晶の常磁性に基づくトラン15日、16日、によって分析手法を使用しました。我々のグループが他の場所で報告したように、この方法では、非侵襲的であり、以下のようにパーコールによる濃縮を受ける寄生虫の侵入率に比べて新鮮な赤血球の侵攻の通常の後処理能力によって示されるように、寄生虫に影響を与えていないようだ勾配遠心分離10、14、17。文化は感染赤血球の数が多いがある場合には、列の結合容量は一度にすべての寄生虫コンテンツを保持するのに十分ではないかもしれないので、この利点に加えて、複数の収集ステップがある場合もあります。十分な寄生虫が与えられ、その後の実験のために収集されるまでは、回収した培養は、カラムを数回渡すことができます。
Pのコレクション熱帯熱マラリア原虫パラ磁気ビーズを利用したサイトは、高速で単純であり、大規模で高価な床の遠心分離機を必要とし、また、サンプルの細心の取扱いを必要とする分画遠心分離技術とは異なり、唯一の卓上遠心機を必要とします。
文化濃縮の一部のアプリケーションでは、起動寄生虫が厳しくすべてのサンプルで制御されている浸潤アッセイにおける寄生虫の使用である;収集寄生虫の使用はhemozoin、マラリアファミリに共通の不活性結晶を抽出するために、高密度の使用寄生虫の顕微鏡分析のために準備するので、彼らは、他の血液細胞と混合される唯一の寄生虫のDNAを抽出する。この最後のアプリケーションは、遺伝的には感染したマラリアの歪みを特定し、情報に基づいた治療計画を立てるための臨床サンプルを分析するために使用することができる。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、CSおよびSecretaríaナシオナルデCiencia yをTecnología（SENACYT）からLCに博士課程奨学金、パナマへの助成PRB-009によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J.
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
