Análisis Coculture de interacciones entre proteínas extracelulares que afectan a la secreción de insulina por las células beta del páncreas

Resumen

Interacciones proteína transcelular son determinantes importantes de la función de las células beta pancreáticas. Detalladas aquí es un método adaptado de un modelo de co-cultivo de sinaptogénesis-para investigar cómo las proteínas transmembrana específicos influyen en la secreción de insulina. Células HEK293 transfectadas expresan proteínas de interés; células beta no necesitan ser transfectadas o de otro modo perturbado directamente.

Resumen

Las interacciones entre las proteínas de la superficie celular ayudan a coordinar la función de las células vecinas. Las células beta pancreáticas se agrupan dentro de los islotes pancreáticos y actúan de forma coordinada para mantener la homeostasis de la glucosa. Cada vez es más claro que las interacciones entre las proteínas transmembrana en las superficies de las células beta adyacentes son determinantes importantes de la función de las células beta.

La elucidación de los papeles de las interacciones particulares transcelular por estudios de caída, knockout o la sobreexpresión en células beta en cultivo o in vivo requiere perturbación directa de ARNm y la expresión de la proteína, afectando potencialmente a la salud de las células beta y / o función en formas que podrían confundir los análisis de los efectos de interacciones específicas. Estos enfoques también alteran los niveles de los dominios intracelulares de las proteínas específicas y pueden prevenir los efectos debidos a las interacciones entre las proteínas dentro de la misma membrana celular para ser disdistinguirse de los efectos de las interacciones transcelular.

Aquí se presenta un método para determinar el efecto de las interacciones específicas transcelular en la capacidad de secreción de insulina y la capacidad de respuesta de las células beta. Este método es aplicable a las líneas de las células beta, como INS-1 en las células, y las células beta primarios disociados. Se basa en modelos desarrollados por cocultivo neurobiólogos, que encontraron que la exposición de las neuronas cultivadas a las proteínas neuronales específicas expresadas en células HEK293 (o COS) capas de células de proteínas identificadas importantes para la conducción de la formación de sinapsis. Dadas las similitudes entre el mecanismo de secreción de las sinapsis neuronales y de las células beta, que razonó que la maduración funcional de las células beta podría ser impulsada por las interacciones transcelulares similares. Hemos desarrollado un sistema en el que las células beta se cultivan sobre una capa de células HEK293 que expresan una proteína de interés. En este modelo, el citoplasma de las células beta está sin tocar mientras extracelular INTERACCIO proteína-proteínans son manipulados. Aunque aquí nos centraremos principalmente en los estudios de la glucosa estimulada por la secreción de insulina, otros procesos pueden ser analizados, por ejemplo, cambios en la expresión génica según lo determinado por inmunotransferencia o qPCR.

Introducción

Se describe aquí un método para facilitar las investigaciones de cómo los dominios extracelulares de proteínas de transmembrana específicos afectan a la secreción de insulina. Las sondas método de los efectos de las interacciones de la proteína de interés con las proteínas (o, posiblemente, otras moléculas) en la superficie de las células beta pancreáticas. El método permite la investigación de cómo las proteínas de la superficie celular expresadas por las células beta o por otras células vecinas (por ejemplo, células endoteliales, neuronas, células alfa pancreáticas) afectan a la función de las células beta a través de interacciones transcelular (es dec....

Protocolo

1. Transfección de células HEK293 Capa

1. Para preparar el medio celular HEK293 mediante la adición a las botellas de 500 ml de DMEM (con 4,5 g / ml de glucosa y rojo de fenol y sin glutamina): 50 ml de FBS, 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina solución, 5 ml 100x solución de L-glutamina y 500 l anfotericina B.
2. Placa cabo HEK293 células en una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de HEK293 media por pozo. Asegúrese de que las células se distribuyen uniformemente a través de la parte inferior de la placa.
3. Cuando las células HEK293 alcanzan el 100% de confluencia, transfectar con 0,8 g de plásmido que codifica la proteína de interés (insertad....

Resultados

Usando el método descrito aquí, se ha probado el efecto de diferentes variantes de la proteína neuroligina sobre la secreción de insulina. Esto complementa nuestro trabajo publicado investigar el efecto de neuroligina-2 en la función de las células beta ^10. Figura 2, por ejemplo, representa los resultados obtenidos a partir de INS-1 cocultivo de las células beta con células HEK293 transfectadas para expresar una isoforma neuroligina se hace referencia aquí como NL- X. Este experimento fue dis.......

Discusión

El método de cocultivo descrito aquí proporciona una forma eficaz para determinar la importancia fisiológica de las proteínas de las células beta-superficie, transmembrana específicos, y específicamente de sus dominios extracelulares. Por el cultivo de las células beta o células de insulinoma (tales como las células INS-1 empleadas aquí) en contacto con las células HEK293 que presentan una proteína de interés en la superficie celular, se pueden diseñar experimentos para determinar los efectos extracelulares de las inter.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pcDNA 3.3 vector/columna vertebral	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
Solución de pluma/estreptococo	Mediatech	45001-652-1
Anfotericina B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
Piruvato de sodio	Mediatech	45001-710-1
2-Mercapt– etanol	Invitrogen	21985023
Separador de células	Mediatech	45000-668
T75 Frasco	BD	1368065
16% Paraformaldehído	Microscopía Electrónica Ciencias 50980487
10x PBS	Mediatech	45001-130
Suero fetal bovino	Mediatech MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
Tampón de lisis RIPA	Sigma	R0278