Artículo de método

Análisis Coculture de interacciones entre proteínas extracelulares que afectan a la secreción de insulina por las células beta del páncreas

DOI:

10.3791/50365

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15 de junio de 2013

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1Pediatric Diabetes Research Center, University of California, San Diego, 2Janssen Research & Development, 3Department of Medicine, University of California, San Diego

En este artículo

Resumen

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Interacciones proteína transcelular son determinantes importantes de la función de las células beta pancreáticas. Detalladas aquí es un método adaptado de un modelo de co-cultivo de sinaptogénesis-para investigar cómo las proteínas transmembrana específicos influyen en la secreción de insulina. Células HEK293 transfectadas expresan proteínas de interés; células beta no necesitan ser transfectadas o de otro modo perturbado directamente.

Resumen

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Las interacciones entre las proteínas de la superficie celular ayudan a coordinar la función de las células vecinas. Las células beta pancreáticas se agrupan dentro de los islotes pancreáticos y actúan de forma coordinada para mantener la homeostasis de la glucosa. Cada vez es más claro que las interacciones entre las proteínas transmembrana en las superficies de las células beta adyacentes son determinantes importantes de la función de las células beta.

La elucidación de los papeles de las interacciones particulares transcelular por estudios de caída, knockout o la sobreexpresión en células beta en cultivo o in vivo requiere perturbación directa de ARNm y la expresión de la proteína, afectando potencialmente a la salud de las células beta y / o función en formas que podrían confundir los análisis de los efectos de interacciones específicas. Estos enfoques también alteran los niveles de los dominios intracelulares de las proteínas específicas y pueden prevenir los efectos debidos a las interacciones entre las proteínas dentro de la misma membrana celular para ser disdistinguirse de los efectos de las interacciones transcelular.

Aquí se presenta un método para determinar el efecto de las interacciones específicas transcelular en la capacidad de secreción de insulina y la capacidad de respuesta de las células beta. Este método es aplicable a las líneas de las células beta, como INS-1 en las células, y las células beta primarios disociados. Se basa en modelos desarrollados por cocultivo neurobiólogos, que encontraron que la exposición de las neuronas cultivadas a las proteínas neuronales específicas expresadas en células HEK293 (o COS) capas de células de proteínas identificadas importantes para la conducción de la formación de sinapsis. Dadas las similitudes entre el mecanismo de secreción de las sinapsis neuronales y de las células beta, que razonó que la maduración funcional de las células beta podría ser impulsada por las interacciones transcelulares similares. Hemos desarrollado un sistema en el que las células beta se cultivan sobre una capa de células HEK293 que expresan una proteína de interés. En este modelo, el citoplasma de las células beta está sin tocar mientras extracelular INTERACCIO proteína-proteínans son manipulados. Aunque aquí nos centraremos principalmente en los estudios de la glucosa estimulada por la secreción de insulina, otros procesos pueden ser analizados, por ejemplo, cambios en la expresión génica según lo determinado por inmunotransferencia o qPCR.

Introducción

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Se describe aquí un método para facilitar las investigaciones de cómo los dominios extracelulares de proteínas de transmembrana específicos afectan a la secreción de insulina. Las sondas método de los efectos de las interacciones de la proteína de interés con las proteínas (o, posiblemente, otras moléculas) en la superficie de las células beta pancreáticas. El método permite la investigación de cómo las proteínas de la superficie celular expresadas por las células beta o por otras células vecinas (por ejemplo, células endoteliales, neuronas, células alfa pancreáticas) afectan a la función de las células beta a través de interacciones transcelular (es decir, a través de interacciones con los compañeros de interacción sobre la superficie adyacente de células beta).

La membrana plasmática celular contiene una serie compleja de proteínas estructurales y funcionales que sirven como puentes para el medio ambiente extracelular. Por formación de conexiones transcelulares o inicio de eventos de señalización de plástico, las interacciones entre las proteínas de la superficie celular puede ayudar a coordinar lala función de las células vecinas. Las células beta pancreáticas están agrupados juntos dentro de los islotes pancreáticos y actúan de forma coordinada para mantener la homeostasis de la glucosa 1. Como se reveló, por ejemplo, por la importancia de la extracelular EphA-ephrinA y neuroligina-2 interacciones en la regulación de la glucosa estimulada por la secreción de insulina, que se está convirtiendo cada vez más claro que el aumento de los conocimientos de las interacciones entre las proteínas extracelulares que se producen en las superficies adyacentes de células beta serán de gran importancia para obtener una comprensión completa de la secreción de insulina, beta maduración funcional celular y el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa 1-3. El objetivo del método descrito aquí es permitir a las investigaciones de los efectos sobre la función de las células beta de las interacciones que implican transcelular transmembrana específico o proteínas de otra manera-de la superficie celular asociadas. Por células beta el co-cultivo con células HEK293 transfectadas con diferentes construcciones de expresión, los efectos sobre el bfunción de las células eta de diferentes proteínas de la superficie celular o variantes mutadas de los mismos puede ser eficiente sondeó. Esto se consigue sin tener que transfectar las células beta a sí mismos.

La elucidación de los papeles de las interacciones particulares transcelular por estudios de caída, knockout o la sobreexpresión en células beta en cultivo o in vivo requiere perturbación directa de ARNm de las células beta y la expresión de la proteína, afectando potencialmente salud de las células beta y / o función en formas que podrían confundir los análisis de los efectos de las interacciones extracelulares específicas. Estos enfoques también altera los niveles de los dominios intracelulares de las proteínas específicas y, además, no permiten que los efectos debidos a las interacciones entre las proteínas sobre o dentro de la misma célula debe distinguirse de los efectos de las interacciones transcelular. Aquí, un método para determinar el efecto de las interacciones específicas transcelular en la capacidad de secreción de insulina y la capacidad de respuesta de las células beta es descrIbed. Este método es aplicable a líneas secretoras de insulina de las células beta, tales como las células INS-1, 4 y para primarias de roedor disociadas o células beta humanos. Se basa en modelos desarrollados por cocultivo neurobiólogos, que encontraron que la exposición de las neuronas cultivadas a proteínas neuronales específicas expresadas en células HEK293 (o COS) capas de células podría identificar las proteínas que la unidad de formación de sinapsis 5,6. Dadas las similitudes entre el mecanismo de secreción de las sinapsis neuronales y de las células beta, que razonó que la función de las células beta y la maduración funcional podrían ser impulsados ​​por las interacciones transcelulares similares 7-9. Con el fin de sondear estas interacciones, hemos desarrollado el sistema descrito en este documento en el que las células beta se co-cultivaron sobre una capa de células HEK293 que expresan una proteína de interés 10. Este sistema permite que el citoplasma de las células beta de permanecer intacta mientras extracelulares interacciones proteína-proteína son manipulados.

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Protocolo

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1. Transfección de células HEK293 Capa

  1. Para preparar el medio celular HEK293 mediante la adición a las botellas de 500 ml de DMEM (con 4,5 g / ml de glucosa y rojo de fenol y sin glutamina): 50 ml de FBS, 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina solución, 5 ml 100x solución de L-glutamina y 500 l anfotericina B.
  2. Placa cabo HEK293 células en una placa de 24 pocillos con 0,5 ml de HEK293 media por pozo. Asegúrese de que las células se distribuyen uniformemente a través de la parte inferior de la placa.
  3. Cuando las células HEK293 alcanzan el 100% de confluencia, transfectar con 0,8 g de plásmido que codifica la proteína de interés (insertado en un vector de expresión de mamífero) y 2 l de Lipofectamina 2000 de acuerdo con el protocolo de Lipofectamina. Hemos optado por utilizar el pcDNA 3.3 backbone diseñado para la expresión en células de mamífero.
  4. Opcionalmente, después de 6 horas de incubación, el intercambio de los medios de transfección se describe en el protocolo Lipofectamine HEK293 con medios normales.
  5. Para evaluar la expresión de la prot transfectadasen, un subconjunto de los pocillos de cultivo de tejidos transfectadas se puede utilizar para la detección de inmunofluorescencia de la proteína expresada o para el análisis de transferencia de Western de expresión de la proteína usando técnicas estándar.

2. Fijación opcional de células HEK293 que expresan la proteína Transfectados

Células HEK293 transfectadas se pueden fijar suavemente con el fin de facilitar el co-cultivo en medios que podrían ser perjudiciales para la vida (por ejemplo, células HEK293 paso 3.9 a continuación) o para permitir la eficiente preparación de antemano de las placas de varios experimentos a la vez (véase también la discusión).

  1. Llevar a cabo estudios piloto para determinar el curso temporal de la expresión de la proteína en las células HEK293.
  2. Después de la transfección de la capa de células HEK293, aspirar los medios de comunicación de las células en el punto de tiempo después de la transfección asociado con más alto nivel de expresión. Si esto ocurre dentro de las primeras 24 horas, no aspirar hasta 24 h después de la transfección.
  3. Lave HEK293 suavemente las células con D-PBS a continuación, añadir 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. (Para obtener la solución PFA 4%, comience con una solución de 16% en PBS 1X y se diluye 1:4 con 1X PBS.)
  4. Usando PBS estéril, lavar suavemente las células 3 veces con PBS y se incuban O / N a 4 ° C.
  5. Lavar las células 3 veces con PBS estéril y añadiendo PBS y dejar a 4 ° C hasta que se necesite (tiempo máximo de almacenamiento puede variar en función de la proteína expresada. Almacenamos células HEK293 transfectadas para expresar isoformas neuroligin hasta 2 semanas sin cambios significativos en los efectos observados sobre la secreción de la insulina).

3. Co-cultivo de INS-1 las células beta con células HEK293

  1. Preparar INS-1 mediante la adición de medios de comunicación a 500 ml de RPMI 1640 (con glucosa y rojo de fenol y sin glutamina): 50 ml de FBS, 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina, 5 ml de 100X solución de L-glutamina, 5 ml de piruvato de sodio, 500 l anfotericina B, 500 l de beta-mercaptoetanol (esto es casi idéntica a la medicinaum usado típicamente para el cultivo de islote primaria a excepción de la adición de beta-mercaptoetanol).
  2. Uso de la célula-separador (u otro removedor de células no enzimático), INS-1 cosecha de células en aproximadamente el 70-80% de confluencia de la parte inferior de un matraz de cultivo T75. Cada matraz proporcionará suficientes células más o menos de 48 pozos.
  3. Después de centrifugar las células en la centrifugadora durante 3 min a 1200 rpm, volver a suspender en una mezcla de medios de comunicación HEK INS-1 y 50/50. En un matraz confluente 70-80% de las células INS-1, volver a suspender en aproximadamente 25 ml de técnica mixta.
  4. Si el uso de células HEK293 que han sido fijados en paraformaldehído en lugar de células vivas HEK293, volver a suspender las células INS-1 en 100% INS-1 media en lugar de técnica mixta.
  5. Usando una pipeta de 10 ml, desprender las células de la pastilla para hacer una suspensión celular homogénea.
  6. Aspire para eliminar los medios de comunicación sobre las células HEK293.
  7. Usando una pipeta P1000, añadir con cuidado 500 l de SIN-1 suspensión celular en la capa de células HEK a lo largo de los lados of pozo. Después de cada 6 pozos, utilizar una pipeta de 10 ml para resuspender las células INS-1 de nuevo para asegurar una suspensión celular homogénea. El esquema general de la co-cultivo de configuración se muestra en la Figura 1.
  8. Se incuban las células durante 24-48 horas, dependiendo del protocolo experimental.
  9. Si se requiere período de co-cultivo de más de 48 horas, utilice los pasos opcionales en la sección 2 anterior para fijar las células HEK293.
  10. Si el uso de roedor disociadas primaria o islotes humanos [por ejemplo, ver los protocolos anteriores en JoVe 11-15], asegurar que un medio apropiado tal como medio RPMI con 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-GLUT, 0,5 ml de anfotericina-B se utilizan en lugar de INS-1 media. Aunque se pueden usar células de los islotes disociados en una placa de 24 pocillos, en la práctica, debido a la gran cantidad de islotes potencialmente necesarios, se recomienda que se considere la posibilidad de ampliación a una placa de 48 (que requiere un menor número de células de los islotes por pocillo). En una placa de 48 pocillos, agregar aproximadamente 100 islotes valor de disociaciónted células por placa para empezar. Dependiendo de la eficacia de la disociación y el método utilizado, puede ser necesario un menor número de islotes.

4. La glucosa secreción de insulina estimulada

  1. Preincubación de células en 250 l de 2,5 mM de glucosa en KRB (tampón de bicarbonato de Krebs-Ringer) durante un mínimo de 1 hora. Para preincubar, quite medio de cocultivo y reemplazar inmediatamente con KRB. Este intercambio se debe hacer un pozo a la vez para minimizar la exposición de las células INS-1 a oxígeno ambiental. Aspirar con una mano mientras pipetear la baja (2,5 mM) KRB glucosa con el otro.
  2. Tipo de KRB preincubación a 250 l de o bien 2,5 mM o 20 mM de glucosa en tampón KRB un pozo a la vez.
  3. Si es apropiado para el experimento específico, se pueden añadir secretagogos adicionales tales como IBMX 100 mM para producir una respuesta secretora de insulina estimulada más robusto. Las células beta de los islotes principales disociadas en particular, son poco sensibles a un aumento de las concentraciones de glucosa alone, por lo que aquí especialmente adición de IBMX o secretagogos de otra debe ser considerada 16,17.
  4. Después de 1 h de incubación, la transferencia de los medios de comunicación para tubos de microcentrífuga y giran 1.500 g durante 5 min.
  5. Retire 200 l del sobrenadante y utilizar este para el análisis de insulina por RIA o ELISA.
  6. Para preparar el lisado de células, añadir 100 ml de RIPA buffer de lisis celular (150 mM de NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 o Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, 50 mM de Tris, pH 8,0) con inhibidores de la proteasa a la placa inmediatamente después de la eliminación de los medios de comunicación y se incuba a 4 ° C durante 20 min.
  7. Centrifugar lisado durante 15 min a 10.000 xg y eliminar 50 l de sobrenadante para el análisis de la insulina por RIA o ELISA.

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Resultados

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Usando el método descrito aquí, se ha probado el efecto de diferentes variantes de la proteína neuroligina sobre la secreción de insulina. Esto complementa nuestro trabajo publicado investigar el efecto de neuroligina-2 en la función de las células beta 10. Figura 2, por ejemplo, representa los resultados obtenidos a partir de INS-1 cocultivo de las células beta con células HEK293 transfectadas para expresar una isoforma neuroligina se hace referencia aquí como NL- X. Este experimento fue dis...

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Discusión

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El método de cocultivo descrito aquí proporciona una forma eficaz para determinar la importancia fisiológica de las proteínas de las células beta-superficie, transmembrana específicos, y específicamente de sus dominios extracelulares. Por el cultivo de las células beta o células de insulinoma (tales como las células INS-1 empleadas aquí) en contacto con las células HEK293 que presentan una proteína de interés en la superficie celular, se pueden diseñar experimentos para determinar los efectos extracelulares de las inter...

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Divulgaciones

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No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01DK080971 y la Fundación de Investigación de Diabetes Juvenil subvención 37-2009-44. También agradecemos el apoyo recibido del Centro de Investigación de Diabetes Pediátrica UCSD (PDRC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
pcDNA 3.3 vector/columna vertebralInvitrogenK830001
Lipofectamine 2000Invitrogen18324012
DMEMMediatech45001-312
Solución de pluma/estreptococoMediatech45001-652-1
Anfotericina BMediatech45001-808-1/30
RPMI-1640Mediatech45001-404
D-PBSMediatech45001-434
Piruvato de sodioMediatech45001-710-1
2-Mercapt– etanolInvitrogen21985023
Separador de célulasMediatech45000-668
T75 FrascoBD1368065
16% ParaformaldehídoMicroscopía Electrónica Ciencias 50980487
10x PBSMediatech45001-130
Suero fetal bovinoMediatech MT35010CV
IBMXSigmaI5879-100MG
Tampón de lisis RIPASigmaR0278

Referencias

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