La arginina-vasopresina (AVP) controla la puesta a punto de la homeostasis del agua corporal facilitando la reabsorción de agua por las células principales renales. A continuación, se presenta un protocolo para el cultivo de la rata medular interna primaria recoger células de los conductos adecuados para la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la reabsorción de agua AVP-mediada.
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Artículo de método
El cultivo primarios de rata medular interna recolección de células del conducto
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Resumen
Resumen
La arginina-vasopresina (AVP) facilita la reabsorción de agua por la recolección de células renales principales conductos y por lo tanto un ajuste fino de la homeostasis del agua corporal. AVP se une a los receptores de vasopresina V2 (V2R) sobre la superficie de las células y por lo tanto induce la síntesis de AMPc. Esto estimula los procesos de señalización celular que conducen a cambios en la fosforilación del canal de agua acuaporina 2 (AQP2). Proteína quinasa A phoshorylates AQP2 y de ese modo provoca la translocación de AQP2 de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática facilitar la reabsorción de agua de la orina primaria. Las aberraciones de la liberación de AVP de la señalización de la pituitaria o AVP-activado en las células principales pueden causar diabetes insípida central o nefrogénica, respectivamente; un elevado nivel de sangre AVP plasmática se asocia con enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca crónica y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética.
A continuación, presentamos un protocolo para cultivatiel de la rata medular interna primaria recoger células del conducto (IMCD), que expresan V2R y AQP2 endógenamente. Las células son adecuados para elucidar los mecanismos moleculares que subyacen en el control de AQP2 y por lo tanto para descubrir nuevas dianas farmacológicas para el tratamiento de enfermedades asociadas con la disregulación de la reabsorción de agua AVP mediada. IMCD células se obtienen a partir de rata renal medullae interior y se utilizan para los experimentos de seis a ocho días después de la siembra. IMCD células pueden ser cultivadas en platos de cultivo de células regulares, matraces y placas de microtitulación de diferentes formatos, el procedimiento sólo requiere unas pocas horas, y es apropiado para laboratorios de cultivo celular estándar.
Introducción
En la recogida de las células principales de conductos renales, arginina-vasopresina (AVP) controla la reabsorción de agua mediante la estimulación de la inserción del canal de agua acuaporina 2 (AQP2) en la membrana plasmática. AVP se une a la proteína de acoplamiento de la vasopresina de tipo receptor de G-2 (V2R) estimulación de la adenilato ciclasa y por lo tanto la formación de AMPc. La iniciación de esta cascada de señalización que conduce a la activación de la proteína quinasa A (PKA). PKA fosforila AQP2 en la serina 256 (S256), que es la clave de activación para su redistribución de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática. La inserción en la membrana facilita la reabsorción de agua a lo largo de un gradiente osmótico y un ajuste fino de la homeostasis del agua corporal.
La desregulación de la reabsorción de agua AVP-mediada, debido a las aberraciones de la secreción de AVP AVP o causas de señalización activadas por o se asocia con enfermedades graves. Disminución de la reabsorción de agua causada por mutaciones de V2R o AQP2 conduce a la diabetes insípida nefrogénica, mientras que un elevsangre ATED nivel AVP plasmática se asocia con la reabsorción de agua excesiva en las enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca crónica y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética (SIADH).
La importancia de la reabsorción de agua AVP mediada deriva no sólo de su implicación en la enfermedad. La translocación inducida por AVP de vesículas AQP2-cojinete a y fusión con la membrana plasmática representa un proceso exocítica estrictamente dependiente de cAMP, que actualmente no se entiende bien. Otros ejemplos para una exocitosis dependiente de AMPc son la secreción de renina en el riñón y la secreción de H + en el estómago. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos moleculares que regulan la AQP2-translocación en células renales principales no sólo ayuda a entender los procesos moleculares similares en otros tipos de células, pero también puede allanar el camino para nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la reabsorción de agua AVP mediada .
Elucidating mecanismos AQP2 requiere el control de recogida de modelos celulares principales del conducto. Para esto un número de diferentes líneas celulares de riñón de mamífero están disponibles. Sin embargo, estos modelos tienen varios inconvenientes. En muchos sistemas de células el nivel de proteínas de AQP2 es baja (Tabla 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, otros ectópica sobreexpresan humanos (MCD4, WT10) 11,12 o de rata (CD8) 13 AQP2. En MCD4 y células COS-7 no se expresa el receptor V2. Para nuestro conocimiento no hay una línea celular permanente como un modelo disponible, que se deriva de la renal interior conducto colector medular, que parte del riñón donde AQP2 expresión es más abundante, pero desde el conducto colector cortical 1,11,13-16 . Tales modelos celulares son por ejemplo el utilizado las mTERT-CCD de 14 líneas celulares establecidas recientemente mpkCCD inmortalizado (por ejemplo 17) o. Ambas líneas celulares expresan endógenamente AQP2 y V2R, pero ya que se derivan de lostúbulo colector cortical probablemente contiene un proteoma diferente en comparación con centro medular recoger células del conducto (IMCD). Por ejemplo, se deben expresar diferentes Na + los sistemas de transporte.
A continuación, presentamos un protocolo de cultivo las células primarias que expresan IMCD V2R y AQP2 endógena. Este modelo, por lo tanto, representa más de cerca la situación fisiológica en el conducto colector renal. Como el establecimiento de la cultura requiere sólo equipo estándar de laboratorio otros laboratorios pueden adoptar fácilmente este método.
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Protocolo
1. Preparación
- Preparación de las placas de cultivo
- Thaw colágeno tipo IV O / N a 4 ° C y se disuelven en 0,1% de ácido acético estéril. El volumen a utilizar depende del tipo y el número de platos en los que las células han de ser sembradas. Utilice 2 mg / cm 2.
- Incubar los platos por lo menos durante 1 hora a TA y se lava dos veces con agua destilada (A. tridest).
- Deje que los platos se sequen correctamente.
- La suplementación de medio
- Aumentar el nivel de glucosa de hasta 4,5 g / l mediante la adición de 1,75 g de glucosa a 500 ml de medio. Para ajustar el medio a 600 mOsmol, añadir NaCl 100 mM y urea 100 mM, para aumentar la osmolaridad de 200 mOsmol y 100 mOsmol, respectivamente.
- Añadir ácidos 1% aminoácidos no esenciales, 1% Ultroser, 500 dbcAMP mM, 20 U / ml de nistatina y 0,25 g / ml de gentamicina (dilución 1:200 de solución madre con una concentración de 50 g / ml) a 600 mOsmol medio DMEM recién en el día de la preparación.
- Solución de la enzima
- Añadir 1 mg / ml de hialuronidasa y 2,2 mg / ml de colagenasa a DPBS que contiene 0,25 mg / ml de gentamicina y nistatina. Preparar 1 ml de esta solución de la enzima para la digestión de 2 riñón medullae interior. La solución debe ser esterilizado por filtración y se almacena en tubos Falcon de 50 ml.
2. El cultivo de rata primaria medular interna recolección de células del conducto (IMCD)
Todos los procedimientos de manipulación de los animales se llevarán a cabo de conformidad con la legislación local y federal.
- Anestesiar ratas en CO 2 (en una caja saturada con CO 2) o isoflurano (U-400 Unidad de Anestesia, Univentor Ltd., Malta, el flujo de aire 350 a 400 ml / min con 2-2,5% isoflurano). Decapita a los animales para el sangrado, que permite la detección exacta de la frontera entre el interior y el blanquecino médula externa más oscura. Además, el sangrado se reduce al mínimo el número de eritrocitos aislados. Retire los riñones ylavarlos en DPBS estéril suplementado con gentamicina y nistatina (véase más arriba) en hielo. Todos los pasos adicionales se llevarán a cabo en condiciones estériles banco limpio.
- Transferir los riñones de la solución de DPBS en una compresa estéril para eliminar el exceso de líquido. Retire la cápsula del riñón graso con pinzas estériles y tijeras.
- Habiendo el riñón todavía fijado en la compresa, cortado ligeramente al lado del eje longitudinal de la parte exterior (cortical). Asegúrese de no cortar por completo, pero dejarlo en una sola pieza, conectado en la pelvis renal.
- Con tijeras curvas diseccionar cuidadosamente la medullae interior blanquecino, que están rodeados por la médula exterior brillante rosado. Recoger en DPBS que contiene gentamicina y nistatina en una placa de cultivo de 60 mm en el hielo.
- Una vez que todos medullae se aíslan y se recogió en hielo, reducir el volumen de DPBS a un nivel en el que están cubiertos sólo con tampón. Use una hoja de afeitar estéril para cortar el medullae en cubos de 5mm 3.
- Derretir y alrededor de la punta de una pipeta Pasteur estéril sosteniéndolo brevemente en una llama. Asegúrese de que la pipeta se enfría antes de continuar.
- Transferir la suspensión de tejido a los tubos Falcon de 50 ml que contenían solución de enzima estéril recién preparado con hialuronidasa y colagenasa (véase 1.3.1) mediante el uso de la redondeada pipeta Pasteur. Cierre la tapa fuertemente y se incuba a 37 ° C bajo agitación continua (220 rpm) en un baño de agua de mesa regular para 1,5 - 2 horas.
- Para la trituración de la suspensión, pipetear la mezcla arriba y abajo varias veces con la ronda pipeta Pasteur (véase más arriba) hasta que la suspensión turbia se vuelve homogénea.
- Centrifugar la suspensión durante 5 min a 300 xg y 16 ° C. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado a fondo en DPBS, que contiene gentamicina y nistatina y centrifugar de nuevo. Repita este paso de lavado una vez.
- Resuspender las células en medio de ellos y de las semillas en c completamente suplementadoULTURA platos y / o placas de pocillos de microtitulación. La preparación de 2 medullae (1 animal) dará lugar a células suficientes para una placa de cultivo de 60 mm.
- Después de 24 horas, lavar las células dos veces con 600 mosmol DMEM y añadir medio fresco. Durante la siguiente semana las células se deben lavar 2-3 veces (Figura 1). 6-8 días después de la siembra, las células IMCD se pueden utilizar para los experimentos. Recuerde que los incuban en medio sin dbcAMP y nistatina durante 24 horas antes de comenzar el experimento. De lo contrario AQP2 se encuentra exclusivamente en la membrana plasmática.
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Resultados
El cultivo exitoso de células IMCD primarios de rata se traducirá en una monocapa confluente 6-8 días después de la siembra (Figura 2). Per 60 mm placa de cultivo hay aproximadamente 6 x 10 6 células. Las células se adhieren firmemente a las placas de cultivo, ya que estos fueron recubiertas con colágeno tipo IV, un componente de la membrana basal 18. Por lo tanto, las células IMCD no separar incluso durante varios procedimientos de lavado a fondo. Hasta el 80% de las células culti...
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Discusión
Se presenta un protocolo detallado para la preparación y el cultivo de células IMCD primarios de rata. El enfoque produce hasta 21 cm 2 de las células de una rata 20. El experimento requiere un equipo de cultivo celular estándar y puede ser llevada a cabo por una sola persona dentro de aproximadamente 6 horas. Por lo tanto, este enfoque es adecuado como un método estándar de laboratorio.
Células IMCD primarios de rata se pueden sembrar en placas de cultivo de diferentes...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL y KL 1415/3-2 1415/4-2).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Colágeno Tipo IV Ratón | BD Biosciences | 356233 | |
| Hialuronidasa | SIGMA | H6254 | |
| Colagenasa tipo CLS-II | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| Nistatina | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| Aminoácidos no esenciales (NEA) | Biochrom AG | K0293 | |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
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Células primarias de IMCD de rataaislamiento de la médula internadigestión enzimática de tejidosprotocolo de cultivo celularseñalización de la arginina vasopresinatranslocación de la acuaporina-2expresión del receptor V2recubrimiento de colágenoanálisis de Western blotmicroscopía de inmunofluorescencia
