Summary
私たちは、膵島抗原特異、プライマリーCD4 + T細胞の養子移入によって2週間以内に、マウスにおける1型糖尿病（T1D）を誘導するための再現可能な方法を提供する。
Abstract
非肥満糖尿病（NOD）マウスは自発的に生後12週間後に自己免疫性糖尿病を開発し、人間の1型糖尿病（T1D）の中で最も広範囲に研究の動物モデルである。照射レシピエントマウスでセル転送研究はT細胞が、このモデルでT1D発症に極めて重要であることを確立した。我々は、本明細書に急速に精製され、プライマリCD4 +膵島特異的T細胞受容体（TCR）NOD.SCIDレシピエントマウスへのBDC2.5トランスジェニック前糖尿病NODマウス由来のT細胞の養子免疫伝達によってT1D誘導するための簡単な方法を述べる。糖尿病誘発T細胞の単離および養子移入は、同じ日以内に完了することができるこの技術の主な利点は、受信者の照射が必要とされないし、T1Dの高い発生率は、T細胞の転送後2週間以内に誘発される。したがって、T1Dにおける病因および治療介入の研究では、不均一なT細胞集団またはクローンに頼る方法よりも速い速度で進むことができます糖尿病NODマウス由来。
Introduction
NODマウスは、自発的に自己免疫性糖尿病を発症し、広く人間T1D 1,2のための動物モデルとして使用されている。 NODマウスにおけるT1Dの病因は、T細胞とB細胞が続き、樹状細胞やマクロファージによるランゲルハンスの膵島の、生後3-4週で始まる、浸潤によって特徴付けられる。非破壊ペリ膵島炎のこの段階では、3歳の4〜6ヶ月まであからさまな糖尿病になり、インスリン産生膵β細胞の遅い、進行性の破壊につながる。 4,5脾細胞、CD4 +糖尿病NODマウスからの6,7またはCD8 + 8,9 T細胞の転送は、膵島反応性T細胞がT1D病因において中心的な役割を果たすことを示す、免疫不全NODマウスにおいて糖尿病を媒介することが示されている。実験条件に応じて、糖尿病は、これらの研究で数週間にわたって、徐々にレシピエントマウスで開発された。同様に、様々なT細胞クローンは時間とコストがかかることによって導出糖尿病誘発T細胞の培養は、数週間レシピエントマウス7,10への移行後に糖尿病を媒介することが報告されている。 CD4-CD8または拘束性糖尿病誘発T細胞クローンに由来するTCRを発現するトランスジェニックマウスの可用性と、いくつかの研究室は、その後、例えば、マウスからの脾臓T細胞は、レシピエント11-13に糖尿病を転送することができたことを示している。具体的には、BDC2.5 NODマウスは、クロモグラニンA、膵β細胞におけるタンパク質14-16に特異的なTCR BDC2.5、トランスジェニックである。あからさまに糖尿病または前糖尿病BDC2.5マウスからin vitroで活性化または非活性化の全体または画し脾臓細胞での転送効率を11,17-19を変えることで、新生児や免疫不全NODマウスに糖尿病を譲渡。
私たちは、精製されたトランスジェニックCD4を利用し簡単な方法+高効率とconsisteでレシピエントマウスにT1D誘導する前糖尿病BDC2.5マウスからT細胞を記述NCY。トランスジェニックTCRVβ4鎖を発現するナイーブ、膵島抗原特異的CD4 + T細胞はCD4ための蛍光活性化細胞選別（FACS）によって、これらのマウスから単離され+ CD62L + T細胞の多数。精製されたトランスジェニックT細胞を、次いで、官能性T細胞およびB細胞を欠き、膵島炎および糖尿病フリー20アールNOD.SCIDマウスに活性化せずに転送される。レシピエントマウスはT細胞移入後2週間以内に急速に発達T1Dを示す尿糖濃度の上昇のために監視されています。
他の方法とは対照的に不均一な特異性を有する糖尿病誘発性T細胞を移すことを、我々のプロトコルは、FACSソートしたCD4 +ほぼ独占的に糖尿病BDC2.5 TCRを発現したT細胞を使用しています。彼らの均質性に起因して、移入されたT細胞（〜1×10 6細胞/マウス）のほんの数は100％の発生率で2週間以内に急速T1D開発のために必要とされる。我々のプロトコルの別の利点は、irradiatioあるレシピエントマウスのnが、それはいくつかの他の方法のためにあるようにする必要はありません。この方法の潜在的な制限は、糖尿病の両方のCD4とCD8 T細胞サブセットまたは特にCD8 T細胞の寄与の調査を許可していないということです。
記述されたプロトコルは、ナイーブ、単一特異的CD4 +標的臓器への膵島抗原特異Th細胞のホーミングに介入するT細胞と同様に、治療戦略により仲介急速T1D開発を研究するために有用であろう。
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Protocol
1。 BDC2.5マウスの脾臓およびリンパ節由来のT細胞の単離
- 糖尿病誘発性CD4 + T細胞のドナーとして6週齢前糖尿病女性BDC2.5マウスを使用してください。尿糖測定（下記参照）によって決定されたマウスは糖尿病フリーでなければなりません。
- CO 2窒息を使用して、各マウスを安楽死させると脾臓を除去し、無菌条件下で腋窩と上腕リンパ節。脾臓を削除するには、70％エタノールで毛皮を浸し、その後カットして肌を撤回。脾臓は、マウスの左側にある暗赤色器官として見えるようになります。小さなハサミを使って腹膜に1インチ切開を加え、そっと小さなピンセットで中央に脾臓を把握する。慎重にできるだけ結合組織および添付脂肪をトリミングおよび脾臓を除去。
- 氷上で15 mlコニカルチューブに10ミリリットルダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中で脾臓とリンパ節を収集します。
- 第を使用して、単一細胞懸濁液を調製しプランジャが優しく同じ50ミリリットルコニカルチューブに70μmのセルストレーナー（こしにつき1脾臓、ストレーナ当たり4-6リンパ節）を通ってリンパ器官を押して滅菌を10mlの注射器の電子終わり。
プロセス中に、ストレーナからの細胞の回収を最大化するために1ミリリットルDMEMで数回各ストレーナーをすすいでください。
- 室温で7分間300-400 XGで15 mlコニカルチューブと遠心分離機に50ミリリットルコニカルチューブから採取した細胞を移す。
- 赤血球を溶解するために、上清を捨て5mlの塩化アンモニウムカリウム（ACK）緩衝液（pH7.2）中で細胞を再懸濁、及び5分間RTでACK細胞懸濁液をインキュベートする。
- ACK-細胞懸濁液にDMEMを10mlを加え、上記のようにチューブを遠心。一回10ミリリットルDMEMで細胞ペレットを洗浄します。
2。糖尿病CD4の蛍光活性化細胞選別BDC2.5 +マウスからのT細胞
- 5ミリリットルFACS s内の再懸濁細胞バッファ寧トリパンブルー色素排除により生存細胞の数（位相差顕微鏡と血球計数器を用いて）数える。
- FACS緩衝液を用いて、5×10 7細胞/ mlの細胞懸濁液の音量を調節する。 〜1染色コントロールあたり×10 6細胞（染色1いや、3つのシングル汚れ）を取り外します。非活性化されたトランスジェニックCD4 +抗CD4とT細胞（APC）、抗TCRVβ4（FITC）及び15 mlチューブ中の抗CD62L（PE）モノクローナル抗体（モノクローナル）のためのサンプルを染色。暗闇の中で4℃で20〜30分間、製造元が推奨するのmAb濃度°Cを用いた細胞染色を行う。
- > 3X染色反応音量でサンプルし、FACSバッファーを持つ単一の染色コントロールを洗ってください。 （1-2×10 7細胞/サンプルをソートするためのMLと300μlの単染色コントロール用）と氷の上で店の隣まで300-400 xgでチューブを遠心、上清を除去し、FACSバッファーで細胞を再懸濁ステップ。
- 35μmのセルを介して細胞サンプルを渡す細胞塊を除去するストレーナーキャップチューブ。訓練されたオペレータとセルソーターでCD4 + TCRVβ4+ CD62L +細胞のためのサンプルをソートします。を15mlチューブに3ミリリットルDMEMに選別された細胞を収集します。 2×10 4合計イベント/秒のソート率で1.5×10 8細胞（3ドナーマウスから得られた細胞の概数）ソートするには、セットアップを含む2.5-3時間を許可します。 〜2.5×10 6非活性ジェニックCD4 +細胞選別後のマウス当たりT細胞を期待しています。
- ソートの末尾に選別された細胞の絶対数を記録し、300から400×gで7分間のためにそれらを遠心。上清を廃棄し、再懸濁細胞（2×10 6細胞/ ml）中の滅菌リン酸緩衝養子T細胞転送用生理食塩水（PBS）マグネシウム（Mg 2 + / Ca 2 +の自由）。
3。糖尿病CD4の養子移入+ BDC2.5マウス由来のT細胞
- 再懸濁FACS精製CD4優しく、1ミリリットルの注射器と18-1½ゲージ針を用いて+1ミリリットルのシリンジをT細胞とをロードします。注射の準備のために、27½ゲージ針で18-1½ゲージの針を交換してください。
- 彼らはグルーミング行動を示すまで加熱ランプに6-8週齢の雌NOD.SCIDレシピエントマウスを公開します。
- 拘束のレシピエントマウスを抑制し、注射部位を消毒するために70％（v / v）のエタノールで自分の尾を拭いてください。
- 外側尾静脈のいずれかに1〜2×10 6 FACS選別された細胞/マウスを（最大で500μlのPBS）に注入します。
プランジャーを無理に押し込まないでください。針が静脈に適切に配置されている場合は、注入はほとんど抵抗なく行われる。
4。高血糖のためにレシピエントマウスの監視とT1D
- T細胞移入後5日から開始して、NOD.SCIDレシピエントマウスは、製造業者の指示に従って、試薬ストリップ（バイエルDiastix）を使用して、上昇した尿糖を毎日監視される。二つの連続urin持つマウス電子グルコース測定値は> 250ミリグラム/ dlと、糖尿病と考えられている。
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Representative Results
我々の結果は、このような膵臓リンパ節などの二次リンパ器官への家へのT細胞のために重要であるCD62Lを発現するトランスジェニックBDC2.5細胞の単離を示す。今回の知見は、さらに急速に転送し、効率的にNOD.SCIDレシピエントマウスにT1Dにするには、この単一特異的T細胞集団の強力な能力を実証する。
糖尿病CD4 + BDC2.5マウス由来のT細胞の単離は、図2に示されている。プールした脾臓およびリンパ節から約5×10 7個の細胞を、細胞選別前のドナーマウス当たり得た。フローサイトメトリーソート続いて、〜2.5×10 6個のトランスジェニックナイーブCD4 + T細胞（CD4 + TCRVβ4+ CD62L +）が表示されたゲーティング戦略を使用して、各BDC2.5ドナーマウスから得た。
CD4 + TCRVβ4+ CD62L +細胞（〜1×10 6細胞/マウス）の少数の予想どおり、養子移入すべてNOD.SCID再でT1D誘起さBDC2.5ドナーマウスから尿中グルコースレベルの上昇（ 図3）で決定される11日、作者cipients（100％の発生率）。比較では、異種のCD3の移転+ BDC2.5 T細胞は3週21で80％NOD.SCID受信者にT1D誘導する3-5倍以上のセルを必要とした。
これらのデータは、より迅速かつ効率的に誘導さT1D NOD.SCIDマウスにFACS精製BDC2.5ジェニックCD4 + CD62L + T細胞の数が少ないと養子移入を示す。
図1。実験的なイベントのシーケンス。脾臓およびリンパ節をBDC2.5マウスから採取した。トランスジェニックナイーブCD4 + T細胞（CD4 + TCRVβ4+ CD62L +）は、FACSによって単離した。 T細胞を、PBS中に再懸濁し、次いでT1Dを示す上昇した尿糖をモニターしたNOD.SCID受信者、に静脈内注射した。
図2。ソートCD4にゲーティング戦略+ TCRVβ4+ CD62L + FACSによってBDC2.5マウスから脾臓およびリンパ節由来の細胞が。プールされた脾臓およびリンパ節の単一細胞懸濁液を、蛍光標識抗CD4（APC）で染色した抗TCR-Vβ4（FITC）、および抗CD62L（PE）モノクローナル抗体。左のドットプロットは、ゲートに右ドットプロットで示さCD62L +細胞を、使用されたCD4 + TCRVβ4+細胞集団を示しています。箱入りの細胞はゲーテッド細胞集団の割合を表しています。
図3。糖尿病CD4 + T細胞の養子移入。FACS分離されたCD4 + TCRVβ4+ CD62L + BDC2.5マウス由来の細胞を静脈内NOD.SCIDレシピエントマウス（n = 5）に（1.3×10 6細胞/マウス）を注射した。マウスWEReは、受信者の尿中グルコース濃度を測定することによりT1Dを監視。 > 250ミリグラム/ dlと、2つの連続測定値を有するマウスは、糖尿病と考えられた。
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Discussion
T1Dは、糖尿病のNODマウスの糖尿病又はT細胞クローンに由来するTCRトランスジェニックマウスからの脾臓細胞全体またはT細胞サブセットの養子移入することにより効率を変化させることで、レシピエントマウスに誘導することができる。我々はここにNOD.SCIDマウスにFACS精製CD62L + BDC2.5ジェニックCD4 + T細胞を転送することにより、100％の発生率で2週間以内に、レシピエントマウスにT1D誘導するための再現性のある方法を報告する。
BDC2.5 T細胞伝達モデルの特定の利点は、自発的な糖尿病カ月、最大糖尿病誘発T細胞サブセットまたはT細胞クローンによる糖尿病の転送のために数週間に比べT1Dの非常に短い誘導時間を含み、ここで説明した。また、その均一性に起因し、BDC2.5トランスジェニックT細胞を精製したわずかな数は、高効率及び一貫性T1D転送するために必要とされる。従来のtraにBDC2.5ジェニックT細胞のin vitroでの活性化のいくつかの他の T細胞転送方法とは対照的に、nsferは、我々のプロトコルでは必要ありません。我々の単一特異的T細胞の転送方法の別の利点は、標的器官への膵島抗原特異的T細胞のホーミングに介入するという新規な治療戦略では、より選択的に他のプロトコルよりも調べることができるように異種T細胞集団で転送糖尿病。
本手法の潜在的な制限は、それが単一特異性、糖尿病CD4 + T細胞は、糖尿病を転送するために使用されるため、両方のCD4 +およびT1D病因におけるCD8 + T細胞サブセットの寄与を決定するために適していないということである。
FACS器具の非存在下で、BDC2.5トランスジェニックT細胞は、CD4 + CD62L +磁気ビーズ（Miltenyi社）、続いてPE-標識抗TCRVβ4モノクローナル抗体および抗-PE磁気ビーズを用いたカラム精製によって単離することができる。
なお、FACS精製なお、ならびにカラム精製T細胞、CD4少量の集団を含むであろう+ T細胞番目すべきであるで内因性TCR遺伝子の不完全な対立遺伝子排除15に起因するトランスジェニックTCRを発現しない。精製されたT細胞画分はまた、レシピエントにT1D発達を抑制することができるCD4 + CD25 + Treg細胞を含むことができる。両方のT細胞集団は、年齢とともにBDC2.5マウスで増加することが報告されているので、私たちは6週間22,23歳以上ではありませんBDC2.5のマウスを使用することをお勧めします。 CD4 + CD25 + Treg細胞は、代わりCD4とFACSソーティングまたは分離によってBDC2.5 T細胞から除外することができます+ CD25古いBDC2.5マウスで+磁気ビーズ（ミルテニー）。
あるいは、または尿糖測定によるT1D監視に加えて、血中グルコースレベルは、ハンドヘルドグルコメーターを使用してレシピエントマウスに、より正確に判定することができる。
このプロトコル内の重要な手順はBDC2.5ドナーとNOD.SCIDレシピエントマウスの年齢が含まれています。若いBDC2.5マウス（6週間）を使用すると、彼らは糖尿病·フリーであることを確認していることになる専用の両方の周波数dogenous非トランスジェニックT細胞とTreg細胞は低く、上記のように指摘した。この株は、24歳の20週間後に現れると養子T細胞の転送後にT1D開発を混乱させることが胸腺腫を開発する傾向があるため、レシピエントマウスとして（<12週）若いNOD.SCIDマウスを使用することも重要です。
記載されている方法の将来のアプリケーションは、ヒトにおける現実的ではありません病気の誘発、選択的に介入するT1D病因と新規戦略のCD4 T細胞媒介機構における調査が含まれています。
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Disclosures
すべてのマウスは、ペンシルベニア州立大学の動物実験のガイドラインに準拠し、委員会を設置し、使用中の薬の特定病原体フリー（SPF）施設のペンシルベニア州立大学で飼育した。
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、博士に感謝します。有益なコメントをロバートBonneauとニールクリステンセン。
この作品は、医学資金のペンシルバニア州立大学によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
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