Este artículo detalla los procedimientos para el análisis de imágenes ópticas de las nanopartículas de tumor específico, Herdox. En particular, se describe aquí el uso detallada del dispositivo de formación de imágenes multimodo para la detección de tumor de la orientación y la evaluación de la penetración del tumor.
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Artículo de método
Análisis de la proteína viral dirigida Nanopartículas Entregado a tumores HER2 +
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Resumen
Resumen
La nanopartícula HER2 + del tumor-específica, Herdox, exhibe acumulación tumoral-preferencial y la ablación de tumores de crecimiento en un modelo animal de cáncer de HER2 +. Herdox está formado por no covalente de auto-ensamblaje de una proteína de penetración celular específica del tumor con el agente de quimioterapia, doxorubicina, a través de un pequeño conector de ácido nucleico. Una combinación de electrofílico, intercalación y las interacciones oligomerización facilitar autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas. Herdox muestra una estabilidad en la sangre, así como en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes. El suministro sistémico de Herdox en ratones portadores de tumores da como resultado la muerte de las células del tumor, sin efectos adversos detectables en el tejido no tumoral, incluyendo el corazón y el hígado (que se someten a daño marcado por la doxorubicina no dirigidos). HER2 elevación facilita orientación a las células que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano, por lo tanto, los tumores se presentan niveles elevados de HER2 presentan una mayor acumulación de Herdox en comparación con las células de expresióncantar niveles más bajos, tanto in vitro como in vivo. La intensidad de fluorescencia de imagen combinada con el análisis y confocal espectral situ nos ha permitido verificar en el tumor vivo focalización y la penetración de células tumorales de Herdox después de la administración sistémica. A continuación te detallamos los métodos de evaluación de tumor de la orientación a través de imágenes multimodo después de la administración sistémica.
Introducción
Tumor-targeting de la quimioterapia tiene el potencial de eliminar las células cancerosas en dosis más baja en comparación a las drogas no orientados, debido a que más de la terapia administrada se puede acumular en su destino previsto, en lugar de distribuir al tejido no tumoral. A medida que la última situación sería diluir la eficacia de la droga y por lo tanto requieren dosis más altas para ser eficaz, tumor-alcance tiene tanto ventajas terapéuticas y de seguridad más de un tratamiento no específico estándar.
Orientación de la quimioterapia mediante encapsulación en nanopartículas auto-ensambladas permite que el fármaco permanezca sin modificar químicamente en contraste con fármacos que se unen covalentemente a moléculas de direccionamiento. Como tal vinculación tiene el potencial de alterar la actividad de ambos el medicamento y la molécula diana; montaje no covalente permite que la potencia del fármaco a ser retenido.
Hemos demostrado anteriormente que la novela de tres componentes, complejos auto-ensamblado, Herdox, se dirige a los tumores HER2 + In vivo y provoca la ablación de tumores de crecimiento sin afectar al tejido normal, incluyendo el corazón 1. Herdox se forma a través de interacciones no covalentes entre la proteína de unión al receptor celular-penetración, HerPBK10, y el agente quimioterapéutico, doxorubicina (Dox), a través de un pequeño conector de ácido nucleico. HerPBK10 se une el factor de crecimiento epidérmico humano (HER) y desencadena la endocitosis mediada por el receptor 2-4, mientras que la penetración de membrana endosomal se lleva a cabo a través de la incorporación de derivados de adenovirus-pentón base de proteína de la cápside 4-6. Un dominio cargado positivamente en la proteína de unión de ácidos nucleicos permite a los 4, 5, a través del cual Dox ADN-intercalado puede ser transportado para la administración dirigida. Electrofílica, intercalación, y posiblemente interacciones oligomerización de proteínas facilitan autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas que son estables en la sangre y en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes 1. Orientación preferencial a HER2 + células tumorales se ve facilitada por la afinidad de ligando de HER2 mejorada cuando se eleva.
Nuestros estudios previos han demostrado que la administración sistémica de los rendimientos Herdox acumulación preferencial en los tumores de más de tejido no tumoral y en comparación con untargeted Dox 1, y la penetración en las células tumorales in vivo 7. Hemos observado que las liberaciones Herdox Dox después de la entrada de células tumorales, lo que permite la acumulación de Dox en el núcleo 1. Tumor-acumulación parece que se correlaciona con el nivel del receptor, como tumores relativamente bajos que expresan HER2 se acumulan menos Herdox comparación con aquellos con niveles comparativamente más altos HER2 1. Por otra parte, la concentración eficaz la muerte celular presenta una correlación inversa con HER2 visualización en líneas de células tumorales que expresan HER2 superficie celular diferentes niveles 1. Herdox presenta una ventaja terapéutica y la seguridad sobre Dox no directo, como el asesinato del tumor se produce en más de la dosis 10 veces menor en comparación con el untardrogas geted y produce ningún efecto adverso detectable en el corazón (detectado por ecocardiografía y tinción histológica) o tejido del hígado (detectado por tinción de TUNEL), en contraste con Dox no directo 1. A pesar de su derivación de una proteína de la cápside viral, HerPBK10 no exhibe inmunogenicidad detectable a niveles terapéuticos 2. Mientras que los anticuerpos pre-existentes a adenovirus conjunto pueden reconocer HerPBK10, no son capaces de impedir la unión de células 2.
El volumen del tumor medido con el tiempo es un método estándar para evaluar la eficacia terapéutica de terapias dirigidas, y se ha empleado para evaluar la eficacia terapéutica de Herdox. Como complemento de este enfoque con in vivo y ex vivo de imágenes de fluorescencia de intensidad nos ha permitido evaluar mejor la eficiencia del objetivo 7. Hemos integrado específicamente en situ imagen confocal de los tumores extirpados con el análisis espectral de Dox fluorescencia para verificar que no Herdoxt sólo acumula en tumores in vivo, pero penetró en las células tumorales y Dox entregado en el citoplasma y el núcleo 7. El análisis espectral, además, nos ha permitido distinguir la fluorescencia Dox de autofluorescencia 7.
Aquí se demuestra en mayor detalle nuestro enfoque para evaluar Herdox in vivo después de la administración sistémica, y lo más importante, para la evaluación de orientación a través de métodos y análisis de imágenes multimodo.
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Protocolo
1. Entrega Sistémica En vivo
- Mezclar suficiente Herdox con solución salina estéril para equiparar 0,2 ml de una mg / kg de dosis de Herdox por inyección de 0.004 para un 6-8 semanas ratón cojinete tumores de xenoinjertos subcutáneos de flanco bilaterales nu / nu viejos.
- Dibujar suavemente la mezcla Herdox en una jeringa de insulina 3/10 cc con una aguja 29G, evitando las burbujas.
- La anestesia se indujo mediante una breve exposición isoflurano en una cámara de inducción equipado con un sistema de barrido de gas (velocidades de flujo de oxígeno: 0,5-1 L / min, la concentración de isoflurano: 3-4% (o inferior).
- Inyectar la mezcla entera en la vena de la cola de un ratón anestesiado (0,2 ml por inyección). Inyección IV también se puede realizar en un restringido, ratón sin anestesiar.
- Repetir las inyecciones en el mismo ratón durante seis días más secuenciales, una vez por día.
2. Fluorescencia de imágenes en vivo
La acumulación de Herdox fluorescencia en los tumores puedeser detectable por el último día de la inyección (Día 7) utilizando un generador de imágenes multimodo. Los siguientes procedimientos implican el uso de un sistema de macro-iluminación y detección personalizada (Figura 1) 8.
- Encienda el Multimodo En vivo Imager óptico.
- Seleccione un filtro de paso de banda de emisión (590 nm ± 30 nm) adecuado para la detección de fluorescencia de la doxorubicina.
- Encienda el láser de Argón Kriptón y coloque un filtro de paso de banda de excitación (488 nm ± 10 nm) en el camino óptico del láser.
- Encienda el sistema de anestesia y luego se coloca un ratón en la cámara anestesiante (caudales de oxígeno: 0,5 a 1 L / min, la concentración de isoflurano: 3-4% (o menos) equipada con un sistema de recogida de gases.
- Transferir el ratón desde la cámara de anestesiar a la cámara de imágenes del Multimodo En vivo Imager óptico cuando el ratón está anestesiado.
- Coloque una ojiva sobre la nariz del ratón y abrir el flujo de administrar anestesia continuasia durante la adquisición de la imagen (caudales de oxígeno: 0,5-1 L / min, la concentración de isoflurano: 2-3% (o inferior).
- Adquirir imágenes de fluorescencia utilizando un tiempo de exposición de 5 a 15 segundos.
- Realizar el análisis y tratamiento de imágenes incluida la corrección de fondo o el ajuste de contraste.
3. Fluorescencia de imágenes ex vivo
Herdox fluorescencia se pueden obtener imágenes de los tumores y los órganos específicos (incluyendo el hígado, riñón, bazo, corazón y músculo esquelético) cosechadas de los ratones sacrificados a las 24 horas después de la inyección final (Día 7) de Herdox.
- Encienda el Multimodo En vivo Imager óptico.
- Seleccione un filtro de paso de banda de emisión (580 nm ± 20 nm) para la detección de fluorescencia doxorrubicina.
- Encienda el láser de Argón Kriptón y coloque un filtro de paso de banda de excitación (488 nm ± 10 nm) en el camino óptico del láser.
- Coloque los tumores y órganos específicos dispuestos en una placa de Petri en la cámara de imágenes of En el Imager óptica multimodo vivo.
- Adquirir imágenes de fluorescencia de los tejidos utilizando un tiempo de exposición de 5 a 15 segundos. Un ejemplo de adquisición de imágenes de fluorescencia inicial se muestra en la Figura 2a. Repita el mismo mediante un placa Petri vacía, lo que servirá de fondo (Figura 2b).
- Realizar el análisis y tratamiento de imágenes incluida la corrección de fondo o el ajuste de contraste. Un ejemplo de una imagen corregida se muestra en la Figura 2c, que resulta de la resta de la figura 2b de la Figura 2a.
4. In situ Imagen confocal de Tumores
En la imagen confocal in situ permite la detección y el análisis de la acumulación tumor Herdox a nivel celular.
- Encienda una SPE microscopio confocal Leica.
- Seleccione 488 luz láser nm para la excitación de la doxorrubicina y la emisión de longitudes de onda (560-620 nm) para la doxorrubicinadetección de fluorescencia.
- Seleccionar un objetivo de 40X o 63X y aceite de inmersión gota en la lente del objetivo.
- Extraer los tumores de los ratones recién sacrificados que hayan recibido previamente tratamientos Herdox y se burlan como se describe en el procedimiento 2.
- Tumores Colocar en una placa de Petri en hielo para evitar la degradación del tejido y, a continuación, transferir los tumores a una cámara de T Delta de imagen confocal.
- Adquirir confocal de imágenes de los tumores a profundidades focales secuenciales (tamaño de paso: 1 m, grueso: 20 micras). Un ejemplo de imágenes secuencialmente-adquiridos a lo largo del eje z se muestra en la Figura 3, panel izquierdo.
- Realizar máxima intensidad z-proyección de las imágenes. Una proyección de intensidad máxima de z-apiladas imágenes se muestra en la Figura 3, panel derecho.
- Cálculo de las intensidades medias de fluorescencia de la intensidad máxima Z -. Imágenes de proyección media de intensidades de fluorescencia de las imágenes sobre el campo de vista global fueron calculard utilizando ImageJ.
5. Spectral Imaging radiométrico y Análisis
Imágenes espectrales y análisis radiométrico permite la discriminación entre Dox fluorescencia y autofluorescencia.
- De alimentación en un microscopio confocal de barrido de fluorescencia láser.
- Adquirir 15 imágenes de los tumores Herdox tratadas y sin tratar a una profundidad especificada en el rango espectral de 510 a 650 nm, con un paso de 10 nm y excitación a 488 nm de luz usando un microscopio confocal Leica SPE.
- Prepare una solución 100 mM de doxorrubicina.
- Realice imagen espectral de la solución de doxorubicina 100 mM para obtener la firma espectral puro Dox fluorescencia (rango espectral: 510 a 650 nm, un tamaño de paso: 10 nm). Los resultados típicos de adquisición de la imagen de formación de imágenes espectrales y espectro de fluorescencia resultante representan como un gráfico se muestra en la Figura 4.
- Adquirir la firma espectral autofluorescencia desde una imagen cube (rango espectral: 510 a 650 nm, un tamaño de paso: 10 nm) obtenida por imágenes espectrales de los tumores no tratados. Los resultados típicos de adquisición de la imagen de formación de imágenes espectrales y espectro de fluorescencia resultante representan como un gráfico se muestra en la Figura 5.
- Generar cuatro firmas espectrales de referencia (autofluorescencia puro, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescencia, 0.2. Doxorrubicina 0.8. Autofluorescencia, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescencia) utilizando el programa que desarrollamos 9. Una curva típica que muestra cuatro firmas espectrales de referencia se muestra en la Figura 6.
- Realizar la clasificación espectral de las imágenes tal como se define por las firmas espectrales de referencia a través de medida de la distancia euclidiana utilizando el programa que previamente desarrollado 9.
- Realizar desmezcla espectral lineal de las imágenes mediante el uso de un programa de desmezcla espectral (plug-in en ImageJ) hemos desarrollado 7, 10, para la comparación con la imagen espectral y radiométrica análisis. Un ejemplo de separar fluorescencia Herdox de autofluorescencia por desmezcla espectral lineal se muestra en la Figura 7.
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Resultados
La Figura 1 muestra el prototipo de imágenes in vivo óptica, que fue construido para el propósito de la adquisición de imágenes bajo múltiples modalidades, incluyendo la intensidad de fluorescencia, espectral, curso de la vida, 2-fotón confocal, intra-vitales, y en imágenes de bioluminiscencia. Además, la alta cámara sensible enfriada y líneas de láser de alta potencia incorporado en este sistema los rendimientos de imágenes de fluorescencia de mayor contraste en comparación con los si...
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Discusión
Dox fluorescencia puede ser detectable in vivo utilizando el generador de imágenes multimodo cuando los tumores son subcutánea. Sin embargo, la dosis terapéuticamente eficaz de Herdox (0,004 mg / kg) está por debajo del umbral de detección después de una sola dosis. En contraste, después de 7 inyecciones diarias (1 vez al día durante 7 días), la acumulación del tumor y la retención de la partícula es suficiente para permitir la visualización de la fluorescencia Dox.
Es de suma impor...
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Divulgaciones
El autor, Daniel Farkas, es Presidente de espectral Imagen Molecular. El resto de autores no tienen intereses en conflicto.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por donaciones a LKM-K de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer (R01CA129822 y R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe gracias C. Rey, M. M-Kauwe y D. Revetto de apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio confocal de barrido láser de fluorescencia | Leica | SPE | |
| em>In Vivo Generador de imágenes ópticas Imágenes | moleculares espectrales | multimodo In Vivo Generador de imágenes | |
| Doxorrubicina-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Ratón desnudo (NU/NU), hembra, 6-8 semanas | Charles River | Código de cepa 088 | |
| MDA-MB-435 células tumorales humanas HER2+ | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| jeringa de insulina de 3/10 cc U-100 con aguja de fijación permanente Ultra-FineIV de 29G x 1/2" | Cámara | 309301 | |
| Delta T | Bioptechs | 04200417B |
Referencias
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