La Ex vivo Modelo de perfusión placentaria humana de doble recirculación se puede utilizar para investigar la transferencia de xenobióticos y nanopartículas a través de la placenta humana. En este protocolo de vídeo se describe el equipo y las técnicas requeridas para una ejecución exitosa de una perfusión de la placenta.
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Artículo de método
Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el
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Resumen
Resumen
Hace que la placenta humana Décadas se pensaba que era una barrera impenetrable entre la madre y el niño por nacer. Sin embargo, el descubrimiento de defectos congénitos inducidos por la talidomida y muchos estudios posteriores después demostró lo contrario. Hoy varios xenobióticos perjudiciales como la nicotina, la heroína, la metadona o medicamentos, así como los contaminantes ambientales fueron descritos para superar esta barrera. Con el creciente uso de la nanotecnología, es probable que entre en contacto con nuevas nanopartículas ya sea accidental o intencionalmente a través de la exposición en el caso de posibles aplicaciones nanomédicos la placenta. Los datos de los experimentos con animales no se pueden extrapolar a los seres humanos debido a que la placenta es el órgano específico de la especie de mamífero más 1. Por lo tanto, la ex vivo de doble recirculación de la perfusión placentaria humana, desarrollado por Panigel et al. 2 en 1967 y modificada continuamente por Schneider et al. En 1972 3, puede servir como un modelo excelente to Estudio de la transferencia de xenobióticos o partículas.
Aquí, nos centramos en la doble ex vivo recirculación protocolo de perfusión placentaria humana y su desarrollo para adquirir resultados reproducibles.
La placenta se obtuvieron después de consentimiento informado de las madres de embarazos sin complicaciones término, sometidas a cesárea. Los vasos fetales y maternos de una cotiledones intactos se canularon y perfundidos por lo menos durante cinco horas. Como modelo de partículas se añaden partículas de poliestireno etiqueta fluorescente con tamaños de 80 y 500 nm de diámetro para el circuito maternal. Las partículas de 80 nm eran capaces de cruzar la barrera placentaria y proporcionar un ejemplo perfecto para una sustancia que se transfiere a través de la placenta hasta el feto, mientras que las partículas de 500 nm fueron retenidos en el tejido de la placenta o el circuito materna. El modelo de la perfusión placentaria humana ex vivo es uno de los pocos modelos que proporcionan información fiable sobreel comportamiento de transporte de xenobióticos en una barrera de tejido importante que entrega datos predictivos y clínicos pertinentes.
Introducción
La placenta es un órgano complejo que es responsable para el intercambio de oxígeno, dióxido de carbono, nutrientes y productos de desecho y, al mismo tiempo capaz de mantener los dos circuitos de la sangre de la madre y el feto en crecimiento separados el uno del otro. Además, se previene el rechazo del niño por el sistema inmune materna y secreta las hormonas para mantener el embarazo. La barrera celular está formada por las células citotrofoblastos que se fusionan y forman un verdadero sincitio sin membranas celulares laterales 4,5. Toda la placenta está organizada en varios cotiledones, que contienen un árbol velloso fetal y representan una unidad func....
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Protocolo
1. Preparación del sistema de perfusión
- Configurar el sistema de perfusión que consiste en un baño de agua, una cámara de perfusión, dos columnas para la oxigenación, dos bombas peristálticas, dos trampas de burbujas, dos calentadores de flujo y un sensor de presión (Figura 1). Conectar estos componentes con secciones de tubo compuestas de los materiales de cloruro de polivinilo de silicona y de acuerdo con el esquema de la figura 2. Por último, hay dos circuitos que representan el circuito fetal y materna, respectivamente.
- Encienda el baño de agua, los calentadores de paso y el calentamiento de la cámara de perf....
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Resultados
La Figura 4A muestra los perfiles de perfusión de partículas de poliestireno pequeñas (80 nm) que se transportan a través de la placenta en comparación con partículas de poliestireno más grandes (500 nm) que no fueron transferidos al compartimento fetal. Cada punto de datos representa la concentración media de partículas hasta el punto de tiempo dado de al menos 3 experimentos independientes. Para obtener nanopartículas de poliestireno de la transferencia placentaria es dependiente de la talla 19.<.......
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Discusión
Debajo de la perfusión recirculante dual mostró aquí, hay varias otras configuraciones experimentales posibles dependiendo de la pregunta que hay que responder. Perfusiones placentarios Particularmente abiertos se utilizan comúnmente para evaluar el aclaramiento del fármaco a una concentración de estado estacionario 3. La perfusión recirculante de configuración se puede aplicar también para confirmar transporte activo de sustancias endógenas o exógenas. Para este enfoque, la misma concentración del xenobiótic.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo está financiado por la Fundación Nacional de Suiza, (NRP programa 64, podrán conceder 4.064 a 131.232).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NCTC-135 medio | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | podría ser reemplazado por Medium 199 de Sigma (M3769) |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Cloruro de potasio (KCl)Farmacia | hospitalaria | también posible: Sigma (P9541) | |
| Fosfato monosódico (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Sulfato de magnesio (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Cloruro de calcio (CaCl, anhidro) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucosa (anhidra) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextrano de Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilina (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| B. Braun Medical AG | 3511014 | ||
| Pellets de hidóxido de sodio (NaOH) | Merck | 106498 | PRECAUCIÓN: corrosivo |
| Ácido ortofosfórico 85% (H3PO4) | Merck | 100573 ATENCIÓN: corrosivo | |
| Mezcla de gases maternos: 95% aire sintético, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Mezcla de gases fetales: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipirina (N-metil-14C) | Productos químicos radiomarcados de Estados Unidos, Inc. | ARCO 0108-50 μ Ci | ATENCIÓN: material radiactivo (actividad específica: 55mCi/mmol) |
| Cóctel de centelleo (IrgaSafe Plus)Zinsser | Analytic GmbH | 1003100 | |
| Partículas de poliestireno 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Partículas de poliestireno 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPAMIENTO | |||
| Baño de agua | VWR | 462-7001 | |
| Termostato | IKA-Werke GmbH Co. KG | 3164000 | |
| Bombas peristálticas | Ismatec | ISM 833 | |
| Trampas de burbujas (vidrio) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Calentador de caudal | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Sensor de presión + Software para análisis | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Oxigenador de intercambio de gases en miniatura | Living Systems Instrumentación | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1,6 mm; OD: 4,8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubos para bombas (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Cánulas romas ( 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Cánulas romas ( 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Cánulas romas ( 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Cánulas romas ( 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Cámara de perfusión con soporte de tejido (plexiglás) | Departamento | Equipos similares están disponibles en Hemotek Limited, Reino Unido Material de | |
| sutura quirúrgico (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Llave de paso multidireccional (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Tijeras quirúrgicas | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Tijeras de disección | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Portaagujas | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Pinzas de disección | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Sistema automatizado de gases en sangre | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Lector de microplacas multimodo | BioTek | Synergy HT | |
| Analizador de centelleo líquido | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Tubos de centelleo 5,5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Homogeneizador de tejidos | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| Medidor de pH + electrodo | VWR | 662-2779 |
Referencias
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L.
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Reimpresiones y permisos
