Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Catheleyne D'hondt; Bernard Himpens; Geert Bultynck

doi:10.3791/50443

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Artículo de método

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

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DOI:

10.3791/50443

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16 de julio de 2013

Catheleyne D'hondt¹ , Bernard Himpens¹ , Geert Bultynck¹

¹Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

En este artículo

Resumen

Intercelular Ca^{2 +} Las ondas son conducidas por canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí se describe un método para medir intercelular Ca^{2 +}-Ondas en monocapas de células en respuesta a un estímulo mecánico de una sola célula local y su aplicación para investigar las propiedades y la regulación de los canales y hemichannels brecha de la salida.

Resumen

La comunicación intercelular es esencial para la coordinación de procesos fisiológicos entre las células en una variedad de órganos y tejidos, incluyendo el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y la vasculatura. En la configuración experimental, intercelular Ca ^{2 +-ondas} puede ser obtenido mediante la aplicación de un estímulo mecánico a una sola celda. Esto conduce a la liberación de las moléculas intracelulares de señalización IP ₃ y Ca ^{2 +} que iniciar la propagación de la Ca ² de la onda ⁺ concéntricamente desde la célula estimulada mecánicamente a las células vecinas. Las principales vías moleculares que controlan intercelular Ca ² de propagación de la onda ⁺ son proporcionados por los canales de salida brecha a través de la transferencia directa de IP ₃ y hemichannels a través de la liberación de ATP. Identificación y caracterización de las propiedades y la regulación de diferentes conexina y isoformas pannexin como canales y hemichannels brecha de la salida son permitidas por el quantification de la propagación de la intercelular Ca ² de la onda ^+, ARNsi, y el uso de inhibidores de canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí, se describe un método para medir intercelular Ca ² de la onda ⁺ en monocapas de células endoteliales corneales primarias cargado con Fluo4-AM en respuesta a un estímulo mecánico controlado y localizado provocado por una deformación aguda, de corta duración de la célula como resultado de tocar la membrana celular con una micropipeta de vidrio micromanipulador-controlado con un diámetro de la punta de menos de 1 m. También describe el aislamiento de células endoteliales corneales bovinas primarias y su uso como sistema modelo para evaluar la actividad Cx43-hemicanal como la fuerza impulsada por intercelular Ca ^{2 +-ondas} a través de la liberación de ATP. Finalmente, se discute el uso, ventajas, limitaciones y alternativas de este método en el contexto del canal brecha de la salida y la investigación hemicanal.

Introducción

La comunicación intercelular y la señalización son fundamentales para la coordinación de los procesos fisiológicos en respuesta a los agonistas extracelular en el tejido y ^1,2 a nivel de todo el órgano. La forma más directa de comunicación intercelular es creada por la aparición de uniones. Gap cruces son las placas de los canales de salida brecha, que son canales proteicos formados por la cabeza a la cabeza de acoplamiento de dos (Cx) hemichannels conexina de células adyacentes ^3,4 (Figura 1). Gap cruces permiten el paso de pequeñas moléculas de señalización con un peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluyendo Ca ^{2 +}