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Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

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DOI:

10.3791/50443

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16 de julio de 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

En este artículo

Resumen

Intercelular Ca 2 + Las ondas son conducidas por canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí se describe un método para medir intercelular Ca 2 +-Ondas en monocapas de células en respuesta a un estímulo mecánico de una sola célula local y su aplicación para investigar las propiedades y la regulación de los canales y hemichannels brecha de la salida.

Resumen

La comunicación intercelular es esencial para la coordinación de procesos fisiológicos entre las células en una variedad de órganos y tejidos, incluyendo el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y la vasculatura. En la configuración experimental, intercelular Ca 2 +-ondas puede ser obtenido mediante la aplicación de un estímulo mecánico a una sola celda. Esto conduce a la liberación de las moléculas intracelulares de señalización IP 3 y Ca 2 + que iniciar la propagación de la Ca 2 de la onda + concéntricamente desde la célula estimulada mecánicamente a las células vecinas. Las principales vías moleculares que controlan intercelular Ca 2 de propagación de la onda + son proporcionados por los canales de salida brecha a través de la transferencia directa de IP 3 y hemichannels a través de la liberación de ATP. Identificación y caracterización de las propiedades y la regulación de diferentes conexina y isoformas pannexin como canales y hemichannels brecha de la salida son permitidas por el quantification de la propagación de la intercelular Ca 2 de la onda +, ARNsi, y el uso de inhibidores de canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí, se describe un método para medir intercelular Ca 2 de la onda + en monocapas de células endoteliales corneales primarias cargado con Fluo4-AM en respuesta a un estímulo mecánico controlado y localizado provocado por una deformación aguda, de corta duración de la célula como resultado de tocar la membrana celular con una micropipeta de vidrio micromanipulador-controlado con un diámetro de la punta de menos de 1 m. También describe el aislamiento de células endoteliales corneales bovinas primarias y su uso como sistema modelo para evaluar la actividad Cx43-hemicanal como la fuerza impulsada por intercelular Ca 2 +-ondas a través de la liberación de ATP. Finalmente, se discute el uso, ventajas, limitaciones y alternativas de este método en el contexto del canal brecha de la salida y la investigación hemicanal.

Introducción

La comunicación intercelular y la señalización son fundamentales para la coordinación de los procesos fisiológicos en respuesta a los agonistas extracelular en el tejido y 1,2 a nivel de todo el órgano. La forma más directa de comunicación intercelular es creada por la aparición de uniones. Gap cruces son las placas de los canales de salida brecha, que son canales proteicos formados por la cabeza a la cabeza de acoplamiento de dos (Cx) hemichannels conexina de células adyacentes 3,4 (Figura 1). Gap cruces permiten el paso de pequeñas moléculas de señalización con un peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluyendo Ca 2 + o IP 3 5, causando y la modulación de Ca 2 +-liberación de los almacenes intracelulares de las células vecinas 6 (Figura 2). Canales de salida brecha están fuertemente regulados por intra e intermolecular interacciones de las proteínas y los procesos de señalización celular, como la modificación redox yfosforilación 7. Gjs facilitar la respuesta coordinada de células conectadas, actuando como un sincitio química y eléctrica. Por ejemplo, la propagación del potencial de acción cardíaco a través de los miocitos auriculares y ventriculares está mediada por canales GJ Cx basados ​​en 85. Cxs no sólo tienen un papel como canales de salida brecha, pero también forman hemichannels no apareados, de esta manera funcionarán como canales en las membranas de manera similar a los canales de iones regulares 8-10 (Figura 1). Hemichannels participan en la señalización paracrina entre las células vecinas mediante el control del intercambio de iones y moléculas de señalización entre el medio ambiente intra-y extracelular.

En muchos tipos de células (como las células epiteliales, células osteoblásticas, astrocitos, células endoteliales, etc) y los órganos (como el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y el sistema vascular), intercelular Ca 2 + olas son fundamentales para la coordinación de las respuestas multicelulares 11. Los aumentos en intracelulares de Ca + niveles 2 en una determinada célula no se limitan a esta célula, pero se propagan a las células vecinas que rodean, estableciendo de ese modo un Ca intercelular 2 de la onda + 12,13. Estos intercelular Ca 2 +-ondas son importantes para la regulación fisiológica normal de las capas de células como un sincitio y su desregulación se ha asociado con los procesos fisiopatológicos 11. En el endotelio corneal y el epitelio, los diferentes grupos de 14-24, incluyendo la nuestra 25-33, estudiaron los mecanismos y las funciones de la comunicación intercelular. En células no excitables, como las células endoteliales de la córnea, dos modos distintos de la comunicación intercelular se producen 28,29, a saber brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina. Brecha ocasiones la comunicación intercelular implica un intercambio directo de moléculas de señalización a través de las uniones comunicantes 7. Gap juncla comunicación intercelular nal es crítico para mantener la homeostasis del tejido, el control de la proliferación celular, y el establecimiento de una respuesta sincronizada al estrés extracelular 10,34,35. En una serie de patologías, acoplamiento brecha de la salida se reduce debido a Cxs defectuosos, y por este medio que afecta brecha ocasiones la comunicación intercelular 36. Esto pone de relieve la importancia y la influencia de la brecha ocasiones la comunicación intercelular en los organismos multicelulares. En contraste con brecha ocasiones la comunicación intercelular, la comunicación intercelular paracrina no depende de la aposición de célula a célula, ya que implica la liberación de mensajeros extracelulares difusibles (Figura 2). Los diferentes tipos de moléculas de señalización se liberan en el espacio extracelular por señalización de células. La molécula se transporta a la célula diana donde se detecta por una proteína receptora específica. Posteriormente, el complejo receptor-señal induce una respuesta celular, que sese termina mediante la retirada de la señal, la inactivación o la desensibilización. Lipofílicas mensajeros de señalización extracelular Lanzamiento penetrar la membrana y actúan sobre los receptores intracelulares. En contraste, mensajeros hidrofílicos no atraviesan la membrana plasmática de la célula responder, sino que actúan como un ligando que se une a las proteínas del receptor expresado en la superficie, que luego se retransmiten la señal para el medio ambiente intracelular. Tres grandes familias de proteínas del receptor de la superficie celular que participen en este proceso: los canales iónicos-ligado, unido a enzima y la proteína G-vinculados. La molécula mensajera liberado puede actuar sobre los receptores de la misma célula (autocrina), sobre las células diana en estrecha proximidad (paracrina), o en las células diana distantes que requieren el sistema circulatorio (endocrina).

En muchos tipos de células, incluyendo endotelio corneal 28,29, ATP es uno de los principales factores hidrófilos, paracrinos que impulsan la propagación de intercelular Ca 2 +-ondas 37-40. DurING deformación mecánica, la hipoxia, la inflamación o la estimulación por diversos agentes, el ATP puede ser liberado de las células sanas 41-44 en respuesta a la tensión de corte, estiramiento, o osmótica hinchazón 44,45. Diferentes mecanismos de ATP de liberación se han postulado, incluyendo exocitosis vesicular 44 y una plétora de mecanismos de transporte, tales como transportadores de unión a ATP de cassette (ABC), canales de aniones dependientes de voltaje plasmalemmal 46, P2X7 canales de los receptores de 47,48, así como conexina hemichannels 49-52 y pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracelular puede ser hidroliza rápidamente a ADP, AMP y adenosina 54,55 por ectonucleotidasas que están presentes en el medio ambiente extracelular. El ATP liberado extracelularmente y su metabolito ADP 56 se extenderán a través de la difusión. La posterior interacción de estos nucleótidos con los receptores purinérgicos en las células vecinas se ha implicado en la propagation de intercelular Ca 2 + olas 28,37,51. Dos clases diferentes de receptores purinérgicos están presentes: la adenosina es el principal ligando natural para P1-purinoceptores, mientras tanto purina (ATP, ADP) y la pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actúan en la mayoría de P2-purinoceptores 57.

La comunicación intercelular puede ser investigado por diferentes métodos, tales como la carga de raspadura, la transferencia de tintes, uncaging local de los agonistas como IP 3 y Ca 2 +, la estimulación mecánica, etc. A continuación se describe el estudio de Ca 2 de propagación de la onda + provocada por la estimulación mecánica de una sola célula. La ventaja de estudiar Ca 2 de propagación de la onda + por estimulación mecánica es que proporciona una herramienta fácil de cuantificar la propagación de la Ca 2 de la onda + en el tiempo y que permite comparar cuantitativamente diferentes pretratamientos de las células. En el endotelio corneal, estos intercelular Ca 2 + olas permiten una corespuesta coordinada de la monocapa, por este medio que actúa como un posible mecanismo de defensa del endotelio corneal no regenerativa ayudar al endotelio para soportar tensiones extracelulares durante la cirugía intraocular, o tras la exposición a mediadores de la inflamación durante el rechazo inmunológico o uveítis 58,59.

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Protocolo

1. Aislamiento de células endoteliales de la córnea

Antes de empezar: Aislar las células de los ojos frescos, obtenidos de un matadero local, tan pronto como sea posible después de la enucleación del ojo. Asegúrese de que el ojo fue enucleado de una vaca de máximos de 18 meses, cinco minutos después de la autopsia y conservados en solución salina equilibrada de Earle - solución de yodo al 1% a 4 ° C para su transporte al laboratorio.

  1. Tome el ojo de solución salina equilibrada de la Earle - solución de yodo al 1% y lo coloca en una placa de Petri (100 x 20 mm).
  2. Esterilizar el ojo con una solución que contiene etanol al 70% y enjuague con solución salina equilibrada de Earle que contiene 1% de yodo.
  3. Partir de este paso, trabajar en una campana estéril. Diseccionar cuidadosamente la córnea del ojo y colocarlo en una placa de Petri (35 x 10 mm) que contiene solución salina equilibrada de Earle, con la capa de células epiteliales hacia arriba. Retire con cuidado el sti tejido del iris restantell unido a la córnea, si es necesario.
  4. Transferencia de la córnea a la Solución salina equilibrada de otra Earle que contiene una placa de Petri con la capa de células endoteliales hacia arriba y enjuague dos veces con solución salina equilibrada de Earle.
  5. Transferir la córnea con la capa endotelial hacia arriba a un reloj de arena, que es un plato en forma de copa, y se cubre con medio de crecimiento. El medio de cultivo consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco que contiene 25 mM de glucosa, 10% de suero fetal bovino, 6,6% de L-glutamina, 2,5 mg / ml de anfotericina-B y 1% de mezcla de antibiótico-antimicótico que contiene 10.000 unidades / ml de penicilina, 10 000 g / ml de estreptomicina, y 25 mg / ml de anfotericina B.
  6. Retirar el medio con una pipeta de aspiración.
  7. Aplicar 300 l de una solución de tripsina (0,5 g / L) a la capa endotelial de la córnea (todos los pasos que incluyen tripsina se realizan utilizando la misma concentración).
  8. Coloque el reloj de arena que contiene la córnea en un plato de Petri cubierto y lo puso en el incubator durante 30 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2.
  9. Raspar suavemente las células endoteliales de distancia de la córnea con un pulido al fuego en forma de gancho pipeta Pasteur de vidrio en una campana estéril.
  10. Aspirar la solución que contiene las células endoteliales y añadirlo a frascos de cultivo (25 cm 2), que contiene 4 ml de medio de cultivo.
  11. Aplicar 300 l de medio de crecimiento a la córnea y repetir el raspado y añadir la solución que contiene las células endoteliales para el frasco de cultivo.
  12. Repita este paso final (1,11) una vez más.
  13. Coloque el matraces de cultivo que contiene las células endoteliales de la córnea en el medio de crecimiento en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2.
  14. Después de dos días, añadir 6 ml de medio de cultivo.
  15. Actualizar el medio de cultivo cada dos días.

2. Cultivo Celular

  1. Retirar el medio de cultivo y se lavan las células dos veces con solución salina equilibrada de Earle, cuando confluencia se alcanza (dentro de About 10 días después del aislamiento).
  2. Añadir 1,5 solución de tripsina ml a las células para separarlas y colocar el matraz en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 3 a 4 minutos.
  3. Añadir 12 ml de medio de crecimiento. Pipetear los medios tres veces dentro y fuera de dispersar las células y contar las células.
  4. Semillas de las células con una fracción variable dependiendo de la densidad de las células y los puso en la incubadora. Preparar dos diapositivas bien recámara (con un área de 4,2 cm 2) con un recuento de células de células 165 000 (densidad celular 39.286 por cm 2). Preparar 80 cm 2 frascos de cultivo de un nuevo paso a una densidad de 6.250 por cm 2, y añadir medio de cultivo nuevo hasta un volumen total de 25 ml.
  5. Actualizar el medio cada dos días.
  6. Confluencia de la capa de células que se alcanza después de 3 a 4 días. Usa las células para los experimentos.
  7. Cuando confluencia de la capa de células en los matraces se alcanza, repita los pasos 2.1 a 2.6. Los cultivos de células hasta el paso 2 se puede utilizar fo experimentos.

3. La estimulación mecánica para inducir calcio Wave

  1. Cargue las células en el portaobjetos de cámara con 10 M Fluo-04 a.m. en buffer fosfato salino durante 30 minutos a 37 ° C mientras se agita suavemente.
  2. Retire el Fluo-04 a.m. solución, lavar las células cinco veces con buffer fosfato salino, incubar las células con tampón fosfato salino y dejar las células durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente antes de la medición.
  3. Excite a 488 nm con láser de argón y el uso divisor de haz HFT 488, recoge la emisión de fluorescencia a 530 nm utilizando un paso largo filtro de emisión LP 505, establece el agujero en el mínimo. Utilice un objetivo de 40X aceite de inmersión (Air, 1,2 NA). En experimentos con ARL-67156, utilice un objetivo de 10X (Aire, 0,3 NA).
  4. Búsqueda de un campo en el que las células son confluentes en el microscopio confocal.
  5. Posición de la pipeta de manera que está en 45 ° con respecto a la corredera de cámara y tocar la membrana celular.Provocar una breve estimulación mecánica (≈ 1 seg) a una sola celda. La estimulación mecánica consiste en una deformación aguda, de corta duración de la célula tocando brevemente menos de 1% de la membrana celular con una micropipeta de vidrio (diámetro de la punta <1 m) acoplado a un nanopositioner cristal piezoeléctrico, operado a través de un amplificador que es montado en un micromanipulador. Las micropipetas de vidrio están hechos de un extractor de microelectrodo. Asegúrese de que la nanopositioner es operado por una tensión de entre 0,2 y 1,5 V durante la estimulación mecánica. Una tensión superior a 1,5 V puede causar daño celular. Para cada tipo de célula y condiciones, la tensión óptima para la estimulación mecánica y sin daño de la célula debe ser determinada cuidadosamente mediante la aplicación de una serie de tensiones a partir de bajo (0,2 V) a alto voltaje (1,5 V). La tensión es una medida de la fuerza de la estimulación ya que esta tensión determina la tensión mecánica y la tensión que se aplica a la membrana celular. Lala fuerza de la estimulación mecánica se puede calcular multiplicando la tensión mecánica con la zona. Dado que tanto la zona (<3,14 m 2) y el estrés mecánico son muy bajos, la fuerza de la estimulación mecánica es baja. (Tenga en cuenta que cuando una célula se daña, las fugas de fluorescencia fuera de la célula y la célula se vuelve oscuro.)
  6. Medir los cambios espaciales de la [Ca2 +] i tras la estimulación mecánica con el microscopio confocal.
  7. Recoger y almacenar imágenes.
  8. Dibuje una región poligonal de interés para definir el área de la superficie total de las células de respuesta (área activa, AA) usando el software del microscopio confocal.

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Resultados

Todos los experimentos se realizan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras y el protocolo que se está demostrado se lleva a cabo bajo la dirección y aprobación del cuidado de los animales y el empleo de la Universidad Católica de Lovaina.

En las células endoteliales corneales bovinas (BCEC), uniones funcionales se expresan y ambos brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina contribuyen de manera significativa...

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Discusión

En este manuscrito, se describe un método simple para medir intercelular Ca 2 + de propagación de la onda en monocapas de células endoteliales corneales bovinas primarias, proporcionando una estimulación mecánica localizada y controlada utilizando una micropipeta. Mecánicamente células estimuladas responden con un aumento local de IP intracelular 3 y Ca 2 +, ambos de los cuales son moléculas de señalización intracelulares esenciales que impulsan intercelular Ca 2 + en la propa...

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Divulgaciones

Los autores tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo de investigación realizado en el laboratorio fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO, números de concesión G.0545.08 y G.0298.11), el Programa Interuniversitario Polos de atracción (Política Científica de Bélgica, el número de concesión P6/28 y P7/13) y está incrustado en una comunidad de investigación FWO apoyado. CDH es un becario posdoctoral de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO). Los autores están muy agradecidos a todos los miembros actuales y anteriores del Laboratorio de Señalización Celular y Molecular (Universidad Católica de Lovaina), Dr. SP Srinivas (Escuela de Optometría de la Universidad de Indiana, EE.UU.), el laboratorio del Dr. Leybaert (Universidad de Gante) y de procedimientos Dr. Vinken (VUB), que proporcionó útil para los debates, optimizado o estuvieron involucrados en el desarrollo de herramientas para el estudio de hemichannels conexina.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina equilibrada de Earle (EBSS)Sondasinvitrogen-gibco-moleculares (Karlsruhe, Alemania)14155-048
yodo Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)38060-1EA
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Sondas invitrogen-gibco-moleculares (Karlsruhe, Alemania)11960-044
L-glutamina (Glutamax)Sondas Invitrogen-Gibco-Moleculares (Karlsruhe, Alemania)35050-038
Anfotericina-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)A2942
Mezcla antibiótica-antimicóticaSondas Invitrogen-Gibco-Moleculares (Karlsruhe, Alemania)15240-096
TripsinaSondas Invitrogen-Gibco-Moleculares (Karlsruhe, Alemania)25300-054
DulbeccoSondas PBSInvitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemania)14190-091
Sondas Invitrogen-Gibco-MolecularesFluo-4 AMF14217
ARL-67156 (6-N,N-dietil-b,g-dibromometileno-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)A265
Apyrase VISigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)A6410
Apyrase VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)Síntesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)Síntesis
Péptido de control (SRGGEKNVFIV)Síntesis
siRNA1 Cx43 (sentido: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) El siRNA recocido se compró en Eurogentec (Luik, Bélgica)
siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) El siRNA recocido se compró en Eurogentec (Luik, Bélgica)
siRNA scramble: secuencia codificada de siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) siRNA recocido se compró en Eurogentec (Luik, Bélgica)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Thermo Electron (Ulm, Alemania)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Alemania)
Portaobjetos de vidrio de dos cámarasLaboratory-Tek Nunc (Roskilde, Dinamarca)155380
Microscopio confocal Carl Zeiss Meditec (Jena, Alemania)LSM510
Piez– nanoposicionador de cristal eléctrico (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Karlsruhe, Alemania)P-280
HVPZT-amplificadorPI Polytech (Karlsruhe, Alemania)E463 HVPZT-amplificador
Tubos de vidrio (reemplazo de vidrio de 3,5 nanolitros)World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, EE. UU.4878
Micr– Tirador de lectrode Zeitz Instrumente (München, Alemania)WZ DMZ-Universal Puller
(Karlsruhe, Alemania)de péptidos personalizadade péptidos personalizadade péptidos personalizada El

Referencias

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