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Artículo de método

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva

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DOI:

10.3791/50466

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10 de marzo de 2013

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En este artículo

Resumen

Un nuevo enfoque de la combinación de trasplante intraocular y microscopía confocal permite longitudinal, no invasiva imágenes en tiempo real con una sola célula de resolución dentro de los tejidos injertados In vivo. Se demuestra cómo trasplantar islotes pancreáticos en la cámara anterior del ojo del ratón.

Resumen

Intravital de imágenes se ha convertido en una herramienta indispensable en la investigación biológica. En el proceso, muchas técnicas de imagen se han desarrollado para estudiar los diferentes procesos biológicos en los animales no invasiva. Sin embargo, una limitación técnica importante en existentes modalidades de imagen intravital es la incapacidad para combinar la no-invasivo, formación de imágenes longitudinal con capacidades de resolución de una sola célula. Se muestra aquí cómo el trasplante a la cámara anterior del ojo elude esta limitación significativa que ofrece una plataforma versátil experimental que permite no invasiva, la imagen longitudinal con resolución celular in vivo. Se demuestra el procedimiento de trasplante en el ratón y proporcionar resultados representativos usando un modelo con relevancia clínica, es decir, trasplante de islotes pancreáticos. Además de permitir la visualización directa en una variedad de tejidos trasplantados en la cámara anterior del ojo, este enfoque proporciona una plataforma para Screen mediante la realización de las drogas a largo plazo de seguimiento y monitoreo en los tejidos diana. Debido a su versatilidad, el tejido / trasplante de células en la cámara anterior del ojo no sólo terapias de trasplante beneficios, se extiende a otras aplicaciones in vivo para estudiar los procesos fisiológicos y fisiopatológicos tales como la transducción de señales y el cáncer o desarrollo de la enfermedad autoinmune.

Introducción

Los avances en microscopía intravital han revelado fenómenos fisiológicos no predichas por los estudios in vitro 1. Esto pone de relieve el desafío en la traducción de los resultados obtenidos por los métodos in vitro convencional en el animal vivo. En la última década, la visualización de los tejidos en los animales vivos se mejoró considerablemente por los avances tecnológicos en las modalidades de imagen 2, 3, 4, 5, 6. Esto ha estimulado la necesidad de enfoques en formación de imágenes in vivo con aplicación factible en modelos animales experimentales para permitir la visualización longit....

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Protocolo

El siguiente procedimiento se realiza bajo el estereoscopio en 2 pasos, el primer paso consiste en cargar los islotes en la cánula y el segundo paso es el trasplante real en la ACE. Todos los procedimientos realizados con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Miami.

1. Islotes de carga en Cánula para trasplante

  1. Centro de los islotes en placa de cultivo al girar el plato en los círculos de estrechamiento.
  2. Desconectar la cánula de la "reserva" y colocar la cánula y el tubo de conexión sobre una superficie limpia. El depósito puede ser hecho d....

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Resultados

Hay algunos parámetros que definen una "buena" trasplante. Un trasplante de buena es la que procede sin sangrado cuando se hace la incisión como se puede ver en el vídeo. El sangrado se impide / minimiza al penetrar sólo la punta del escalpelo (aguja) en la ACE (Figura 3a). Esto también ayudará a evitar el contacto y la punción del iris. También se asegurará de una pequeña incisión que se curan muy bien sin causar opacidad de la córnea con el tiempo (Figura 3c, d). Otro aspect.......

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Discusión

Islotes pancreáticos de murino fueron aisladas utilizando digestión con colagenasa seguido por purificación en gradientes de densidad, como se ha descrito previamente 33. Islotes aislados se cultivaron durante la noche antes del trasplante. Si bien esto puede no ser necesario, se recomienda para permitir que los islotes de recuperarse del procedimiento de aislamiento. Esto es crítico cuando se realiza el trasplante en los receptores diabéticos, ya que garantizará el trasplante de islotes sobrevivientes / robu.......

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Divulgaciones

PO.B. Es uno de los fundadores de la empresa de biotecnología BioCrine, que se va a utilizar la cámara anterior del ojo como una plataforma de servicio comercial. AC se encuentra en la patente que protege esta tecnología.

Agradecimientos

Reconocemos los Dres. Camillo Ricordi, Pileggi Antonello, R. Damaris Molano, Speier Esteban y Daniel Nyqvist para un debate fructífero. También damos las gracias Eleut Diego Hernández y Espinosa-Heidmann de asistencia técnica, y Mike Valdes y Formoso Margaret ayuda con grabación de video. Byron Maldonado grabado, editado y producido el vídeo final. Apoyo a la investigación fue proporcionada por el Instituto de Investigación de Diabetes Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), el NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA, NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 a PO.B.). Apoyo a la investigación adicional para PO.B ....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre de reactivo Empresa Número de catálogo Descripción / Comentarios
IsoTHESIA (isoflurano) Buttler Animal Health Supply 11695-6775-2 99,9% de isoflurano / ml
Ketaset (Ketamina HCL) Fort Dodge Animal Health 0856-2013-01 Anestesia inyectable Alternativa
Beprenex (buprenorfina HCL) Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. 12496-075-7-1 0,3 mg / ml
Ophthalmic eritromicina ungüento USP, 0,5% Akron 17478-070-35 Aplicado preventivamente a ojo trasplantado
0,9% de cloruro sódico (solución salina) Hospira Inc. 0409-7983-03 Para la inyección iv. Estéril
PBS Gibco 10010-023 1X. Estéril
CMRL medio 1066 Cellgro 98-304 CV- Complementado, CIT modificación. Los medios preferidos para islotes

Referencias

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O.

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Reimpresiones y permisos

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