Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Resumen

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Resumen

Un bacteriófago lítico estructuralmente transformado que tiene una amplia gama de huéspedes de cepas de Staphylococcus aureus y una proteína de unión a penicilina (PBP 2a) de anticuerpos conjugados con perlas de látex se han utilizado para crear un biosensor diseñado para la discriminación de resistente a la meticilina (SARM) y sensible a la meticilina (SASM) S . especies aureus ^1,2. Los fagos líticos se han convertido en esferoides de fagos por el contacto con la interfase agua-cloroformo. Fagos monocapas esferoide se han movido en una superficie biosensor de Langmuir-Blodgett (LB) Técnica ^3. Los biosensores creados han sido examinados por una microbalanza de cristal de cuarzo con seguimiento de disipación (QCM-D) para evaluar las interacciones bacteria-fago. Interacciones bacteria-esferoide llevaron a la reducción de la frecuencia de resonancia y un aumento de la disipación de la energía, tanto para las cepas de SARM y SASM. Después de la unión bacteriana, estos sensores han sido expuestos más al anticuerpo de proteína de unión a penicilina perla de látexs. Sensores analizados con MRSA respondieron a PBP 2a cuentas de anticuerpos, aunque sensores inspeccionados con SASM dieron ninguna respuesta. Esta distinción experimental determina una discriminación inequívoca entre resistente a la meticilina y S. sensible cepas de Staphylococcus. Igualmente consolidados y no consolidados bacteriófagos suprimen el crecimiento de bacterias en las superficies y en suspensiones de agua. Una vez que los fagos líticos se transforman en esferoides, que conservan su fuerte actividad lítica y muestran una alta capacidad de captura bacteriana. Los esferoides de fago y los fagos se pueden utilizar para la prueba y la esterilización de los microorganismos resistentes a los antibióticos. Otras aplicaciones pueden incluir el uso en la terapia de bacteriófagos y las superficies antimicrobianas.

Introducción

Cepas resistentes a la meticilina de Staphylococcus aureus se han sugerido como un factor en las infecciones esenciales y los brotes nosocomiales ^4-8. Las formas más comunes de reconocimiento de la resistencia a la meticilina, tales como la prueba de difusión en disco oxacilina agar pantalla, o de microdilución en caldo, se basan en las condiciones de cultivo a medida para mejorar la expresión de la resistencia. Las alteraciones incluyen la utilización de oxacilina, incubación a 30 o 35 ° C en lugar de 37 ° C, y la inclusión de NaCl al medio de crecimiento. Por otra parte, para la detección correcta de estos tipos de técnicas, en lugar de 16 a 18 ....

Protocolo

1. Preparando el escenario

1. Obtener la cepa de tipo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 y Bacillus subtilis ATCC 6051. Cepas resistentes a la meticilina de S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, 13 MRSA, MRSA 26, 34 MRSA, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; El fago lítico 12600.
2. Obtener PBP 2a anticuerpos conjugados con perlas de látex.
3. Preparar medio NZY tal como se describe ^21.
4. Obtener solución tamponada con fosfato salino (PBS).

Resultados

El fago demostró actividad lítica contra todas las cepas ensayadas de S. aureus, incluyendo cepas de MRSA, tal como se indica por la prueba de la mancha fago. Tamaños de placa generalmente variaron de 5 a 15 mm. No se encontró actividad contra otros-cultivos de ensayo (Tabla 1).

Un crecimiento normal de S. aureus ATCC 12600 en un medio NZY en un agitador-incubador a 37 ° C se muestra en la Figura 1A (una curva marcada por círculos vacíos). .......

Discusión

Es bien sabido que los fagos se pueden utilizar como sondas de biosensores para patógenos bacterianos ^28. Se demuestra en este trabajo que fago junto con anticuerpos PBP 2a puede ser utilizada para resolver el viejo problema: las cepas resistentes y sensibles a antibióticos discriminación rápidos.

Se encontró sin embargo esos fagos de estafilococos no modificados normales no son adecuados para la detección de bacterias con dispositivos QCM, a pesar de que las bacterias se unen. La.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
cloroformo de grado espectrofotométrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexano-Anhidro	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0(	95%)
Alcohol etílico	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a perlas de látex conjugadas con anticuerpos	Denka Seiken Co., Ltd, Tokio, Japón	La prueba
de pantalla MRSAS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 y Bacillus subtilis ATCC 6051 de	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; El fago lítico 12600	La colección de cultivos de la Universidad de Auburn, Auburn, AL
Centrífuga	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifugadora
KSV 2200 LB Balanza de película	KSV Chemicals, Finlandia
Sistema óptico de microscopio óptico	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä stra Frö lunda, Suecia	E4
Microscopio electrónico de barrido (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilizado	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μ m, placa de bioensayo de membrana GP Express PLUS
	NUNC A/S, Dinamarca	240835	Dimensiones (mm), 245 x 245 x 25
Pipetas	Gilson, Pipetman, Francia	P100, P200, P1000
Incubadora C24 Agitador	Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Piezas de cuarzo recubiertas de oro	Auburn University, AL
Placas	de Petri caserasFisher Brand, EE. UU.	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Matraces de cultivo	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Matraces Erlenmeyer
Espectrómetro óptico	Genesys 20. Thermo Spectronic, Estados Unidos.	4001
Limpiador de plasma	Harrick Plasma, EE. UU.	PDC-32G
Sistema de purificación de agua Millipore	Millipore	Direct-Q
	Accurion, EE. UU	. nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Suecia	QSoft, QTools