Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Resumen

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Resumen

Las propiedades mecánicas de las células y la matriz extracelular (ECM) desempeñan papeles importantes en muchos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación de células madre, la formación del tumor, y la cicatrización de heridas. Los cambios en la rigidez de las células y ECM son a menudo signos de cambios en la fisiología celular o enfermedades en los tejidos. Por lo tanto, la rigidez de células es un índice para evaluar el estado de los cultivos celulares. Entre la multitud de métodos aplicados para medir la rigidez de las células y tejidos, micro-indentación usando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) proporciona una manera de medir de forma fiable la rigidez de las células vivas. Este método ha sido aplicado ampliamente para caracterizar la rigidez de micro-escala para una variedad de materiales que van desde superficies metálicas a los tejidos biológicos blandos y células. El principio básico de este método es para sangrar una célula con una punta de AFM de la geometría seleccionada y medir la fuerza aplicada a partir de la flexión del cantilever de AFM. Montaje de la curva fuerza-sangría para el modo de Hertzl para la geometría de la punta correspondiente puede dar mediciones cuantitativas de la rigidez del material. En este trabajo se demuestra el procedimiento para caracterizar la rigidez de las células vivas utilizando AFM. Se demuestran los pasos clave, incluyendo el proceso de calibración de AFM, la adquisición de la fuerza de la curva, y el análisis de datos mediante una rutina de MATLAB. También se discuten las limitaciones de este método.

Introducción

Las propiedades mecánicas, especialmente la rigidez, de células individuales y sus matrices extracelulares que rodean (ECM) son fundamentales para muchos procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la motilidad, la división, diferenciación, y la homeostasis del tejido. ¹ Se ha demostrado que la rigidez mecánica de células está determinada principalmente por el citoesqueleto, especialmente las redes de actina y filamentos intermedios y otras proteínas asociadas con ellos. ² Los resultados de ensayos mecánicos sobre en redes in vitro de actina y filamentos intermedios sugieren que la mecánica de células es dependiente en gran medida de la estructura del citoesqueleto y la pre-tensión en el citoesqueleto. ^3-5 Rigidez de células vivas se considera entonces como un índice para evaluar la estructura del citoesqueleto ^6, la actividad de la miosina ⁷ y muchos otros procesos celulares. Más importante aún, los cambios en las propiedades mecánicas de células también se encuentran a menudo para ser estrechamente asociadosocasionada por la diversas condiciones de enfermedad, tales como la formación de tumores y la metástasis ^8-10 Control de la rigidez mecánica de las células vivas por lo tanto, puede proporcionar una nueva manera de controlar la fisiología celular;. para detectar y diagnosticar enfermedades ^8;., y para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos ^{11 , 12}

Múltiples métodos incluyendo microrheology partícula de seguimiento, ^13-16 magnética citometría de torsión, ¹⁷ micropipeta aspiración ^18,19 y microindentación ^20-22 se han desarrollado para medir la elasticidad de las células. Partículas microrheology seguimiento rastrea las vibraciones térmicas de cualquiera de las partículas fluorescentes submicrométricos inyectados en células o marcadores de referencia dentro del citoesqueleto celular. ²³ propiedades elásticas y viscosas de células se calculan a partir de los desplazamientos de partículas medidos utilizando el teorema de fluctuación-disipación. ^14,23 Este método permite mediciones simultáneas de localespropiedades mecánicas con alta resolución espacial en distintos lugares de una célula. Sin embargo, la inyección de partículas fluorescentes en las células puede conducir a cambios en la función celular, la estructura del citoesqueleto, y por lo tanto la mecánica celular. El método de aspiración con micropipeta se aplica presión negativa en una micropipeta de diámetro varía de 1 a 5 micras para aspirar una pequeña pieza de membrana celular en la pipeta. Rigidez celular se calcula a partir de la presión negativa aplicada y la deformación de la membrana celular. ¹⁸ Este método, sin embargo, no puede detectar la distribución heterogénea de la rigidez a través de la célula. Citometría de torsión magnética (MTC) se aplica el campo magnético para generar par de torsión sobre perlas de súper paramagnéticas unidas a la membrana celular. ¹⁷ rigidez célula se deriva en este método a partir de la relación entre el par aplicado y la deformación de torsión de la membrana celular. Es difícil controlar la ubicación de perlas magnéticas en el método de MTC, y también es challenging para caracterizar la deformación de torsión con alta resolución. Microindentación se aplica un penetrador con una geometría bien definida para perforar en la célula. La fuerza de penetración y la indentación resultante en las células a menudo siguen la predicción del modelo de Hertz. Módulos de Young de las células se puede calcular a partir de las curvas de fuerza-indentación ajustándolas al modelo de Hertz. Este método ha sido ampliamente aplicado para probar las propiedades mecánicas de los tejidos y las células a pesar de sus limitaciones, tales como la incertidumbre en la determinación del punto de contacto, la aplicabilidad del modelo de Hertz, y el potencial para dañar físicamente las células. Entre los muchos dispositivos para microindentaion ^20, el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) está disponible comercialmente y se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células y tejidos vivos ^21,24-27.

En este trabajo se demuestra el procedimiento de utilizar un asilo MFP3D-Bio AFM para caracterizar la mecánica celular. AFM no enLY proporciona topografía de alta resolución de las células, pero también se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células del tejido. El principio de AFM indentación se ilustra en la Figura 1. El cantilever de AFM se aproxima a la célula desde unos pocos micrómetros más arriba; hace contacto con la célula; guiones la célula de modo que la deflexión voladizo alcanza un punto de consigna preseleccionado, y se aleja de la célula. Durante este proceso, la deflexión en voladizo se registra como una función de su ubicación, como se muestra en la Figura 1. Antes de hacer contacto con la célula, el voladizo se mueve en el medio sin ninguna desviación aparente. Cuando sangría en la célula, las curvas en voladizo y se incrementa la señal de deflexión. Los voladizos se modelan como vigas elásticas para que su desviación es proporcional a la fuerza aplicada a la célula. Al establecer la deflexión máxima en voladizo, la máxima magnitud de la fuerza aplicada a la muestra es limitada para evitar dNingún daño a las células. La porción de la curva de fuerza desde el punto B al punto C en la Figura 1, donde los guiones punta en la célula, se adaptan al modelo de hercios para extraer la rigidez celular.

Figura 1. Ilustración de la AFM microindentación e interpretación de la curva de fuerza. El panel superior muestra el movimiento de la AFM voladizo accionada por el escáner piezoeléctrico. La ubicación vertical del voladizo z y la deflexión en voladizo señal d se registra durante el proceso. El voladizo se inicia desde el punto a, unos pocos micrómetros por encima de la celda. Al acercarse a la célula, la muestra δ indentación permanece en cero hasta que se alcanza el punto B, donde la punta entra en contacto con la célula. Las coordenadas del punto b en el diagrama son valores críticospara el análisis de datos, que se denota por (z _0, d _0>). De B ​​a C, los guiones en voladizo en la célula hasta que la deflexión voladizo llega a un punto de ajuste, que se ajusta para que sea la relación entre la fuerza de penetración máxima al final del voladizo y la constante del resorte. Una vez que la señal de deflexión alcanza el valor máximo prefijado, el voladizo se retira entonces de la célula al punto d, donde a menudo ser tirado hacia abajo debido a la adhesión de la punta-de la muestra, se separa de la célula y vuelve a su ubicación inicial en el correo. El panel de la derecha ilustra la relación entre la indentación y la z grabada y la señal d. En en el panel inferior izquierdo es un gráfico de una curva representativa fuerza, la indentación máximo de un voladizo, de que la constante del resorte se mide a ser 0.07N / m, se ajusta para que sea 17 nm de manera que la fuerza máxima aplicada a la sangría muestra es 1,2 nN. Los puntos clave durante el sangrado se marcan.

Protocolo

1. Calibrar la constante del resorte del voladizo

1. Cargar el voladizo en el AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es necesario limpiar el soporte voladizo con etanol antes de cualquier experimento. Esto ayudará a limitar la contaminación bacteriana de la cultura durante las mediciones de AFM.
2. Calibrar InvOLS (Inverse Sensibilidad palanca óptica). Este parámetro describe la cantidad de respuesta de fotodiodo (voltios) por nanómetro de deflexión voladizo.
3. Cargar un portaobjetos de vidrio limpio en la etapa de la muestra, a continuación, instalar la cabeza AFM y ajustar el haz de láser y la alineación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enganche la punta del AFM en el portaobjetos de vidrio.
4. Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una medición espectroscopia de fuerza con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V.
5. Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una force medición espectroscopía con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Los valores de tensión aquí son específicos para el Asilo de AFM. Este valor debe establecerse de acuerdo con las especificaciones establecidas por el fabricante.
   Después de la adquisición de datos es completa, hacer zoom en la región firme contacto de la curva de fuerza. Realizar un ajuste lineal a esta región para encontrar la pendiente, que estará en V / nm. El recíproco de este valor describe la sensibilidad óptica del conjunto voladizo-fotodiodo.
6. Cambiar la alineación del espejo a una desviación gratuita de 0 V.
7. Calibrar la constante de resorte en voladizo. Un método térmico-sintonía se utiliza para determinar la constante del resorte en voladizo ^28.
8. Después de calibrar los InvOLS, elevar el escáner fuera de la etapa de la muestra de tal manera que no hay interacciones entre la punta y la muestra.
9. Comienza la captura de los datos térmicos. Durante este proceso, la vibración térmica de la viga en voladizo es Recorded. El software AFM analiza un espectro de potencia de una vibración y se representa en una ventana de datos térmicos tales.
10. Después de unos pocos segundos de adquisición de datos, realizar un ajuste para el segmento de datos centrada en la más baja-frecuencia (resonancia fundamental) pico para determinar la constante del resorte.

2. Carga de la muestra

1. Instale el accesorio calentador del plato en el escenario AFM, si no está ya equipado.
2. Ajustar la temperatura a 37 ° C, y esperar 20 minutos para que el sistema alcance un equilibrio térmico estable.
3. Coloque la placa de cultivo en la etapa de AFM y fijarlo con la abrazadera suministrada con el calentador de plato. Es importante reducir al mínimo el tiempo entre la retirada de la placa de la incubadora y colocándolo en el escenario, para evitar el trauma a las células. Para las mediciones de más de 30 min, se debe utilizar CO ₂ medio independiente para reemplazar el medio de cultivo normal.
4. Aplicar una pequeña gota de 37 ° C el medio de cultivo a la punta de tque AFM voladizo, y bajar la cabeza hasta la punta de AFM se acaba sumergido en líquido.
5. Uso de la cámara CCD vista superior, vuelva a alinear el haz de láser en el voladizo (la alineación en el líquido será diferente que en el aire, debido al cambio en el índice de refracción del medio).
6. Enganche la punta del AFM en una zona limpia de la placa de cultivo.
7. Realice la calibración de los InvOLS como se describe anteriormente, para la sensibilidad voladizo en el medio líquido.

Nota: a) Si las células se cultivan en hidrogeles, la calibración de InvOLS se debe realizar de antemano contra la superficie inferior de una placa de cultivo lleno de medios de cultivo celular. Al cambiar a muestras de células, la atención especial se ha de pagar para no cambiar la alineación del haz láser con el voladizo. b) InvOLS tiene que ser recalibrado cada vez que hay un cambio en la alineación láser. c) También se recomienda tomar InvOLS como el promedio del valor de varias curvas de calibración, sesde cada calibración genera un diferente InvOLS. La variación en InvOLS es, sin embargo, pequeña en comparación con el valor medio. Por ejemplo, calibrar un DNP-10 cantilever Bruker con constante 0,06 N / m de líquido en 100 veces la primavera producir un valor InvOLS media de 66,3 nm / V, con una desviación estándar de sólo 0,5 nm / V.

3. Recopilación de curvas de fuerza de sangría célula

1. Seleccione una celda para el sangrado. Con la ayuda del microscopio óptico, mover la etapa de posicionar el voladizo por encima de la celda de modo que la punta se encuentra en la región peri-núcleos. Ajuste preciso de la posición de voladizo se puede lograr mediante la aplicación de las compensaciones a las direcciones X e Y escáneres.
   Nota: El cantilever de AFM tiene que ser retirado de la superficie de la muestra mientras se mueve la etapa de la muestra para seleccionar una célula diana. Esto protege el voladizo de golpear en la muestra, ya que la superficie de la muestra puede no ser plana.
2. Cambiar a forzar el modo de Espectroscopía. Establezca la sangríacomprendida dentro de la gama de 1-10 m / seg, lo suficientemente bajas para evitar efectos hidrodinámicos.
3. Ajuste del punto de disparo de desviación, lo que limita la fuerza máxima de sangría para evitar daño a las células. Seleccionar la opción de activación relativa, que para corregir cualquier desviación en la señal de deflexión. La fuerza máxima de 2 nN es un buen punto de partida para la mayoría de las muestras. Este valor, sin embargo, debe ser ajustado de acuerdo a la rigidez de la muestra. Para las muestras suaves un valor más bajo se debe utilizar para evitar la sangría excesiva a la muestra. Para las muestras de rigidez un valor alto se debe utilizar para generar indentación medible.
4. Ajustar la distancia de la fuerza lo suficientemente grande como para asegurar que la punta estará totalmente separada de la célula entre las medidas de fuerza. Por lo general, la distancia de la fuerza se establece en 5 micras.
5. Dirige el AFM para tomar una sola curva de fuerza.
6. Recoge al menos tres curvas de fuerza en diferentes lugares en la región peri-núcleos de cada célula. Aunque es beneficioso tomar múltiplescurvas en cada celda de datos estadísticos fiables, teniendo demasiadas curvas de fuerza puede conducir a cambios en la rigidez celular debido a la tensión de la sonda de AFM.
7. Cuando la recolección de datos se completa, retire la punta, y repita los pasos 3.1 a 3.6 por tantas células como sea necesario para los buenos datos estadísticos sobre la rigidez celular bajo una cierta condición de muestra. Por lo general, las células 30 se miden para cada condición.

Para caracterizar la distribución de la rigidez dentro de una sola célula, se aplica el modo de fuerza-mapa. En el modo de trabajo de ruta, establezca un tamaño de escaneado para incluir la región de interés, establecer una resolución adecuada, establecer los parámetros de sangría que las seleccionadas para las curvas de fuerza individuales, el AFM Luego de trama a través de la zona de muestreo definido y tomar curvas de fuerza individuales en cada pixel en la región de la muestra.

4. Análisis de Datos

Las curvas de fuerza registrados se analizaron mediante un procedimiento de encargo MATLAB para calcular la rigidez de células. La siguiente es una breve descripción del procedimiento de MATLAB:

1. El programa MATLAB identifica el punto de contacto coordina z0 y d0 (véase la Figura 1) utilizando un algoritmo adoptado de un método publicado por Lin et al ^29.:
2. Para cada punto de datos de la curva de fuerza, lleve a cabo un ajuste lineal de los datos a la izquierda del punto de interés, y un modelo de Hertz encaja a la derecha (con el punto seleccionado como el punto inicial de contacto), hasta el conjunto máxima muesca (200-300 nm recomendado).
3. Para cada punto, se calcula el error RMS relativa de los dos ataques y la suma de estos valores.
4. El punto que alcanza el error de ajuste total mínima es seleccionado como el punto inicial de contacto.
   Nota: El tiempo de cálculo puede reducirse mediante la aplicación de una búsqueda de sección áurea-en lugar de escaneado linealmente toda la curva de la fuerza.
5. Muestra δ deformación y la sangría de la fuerza F se calcula como:
   
6. Un ajuste de mínimos cuadrados se aplica para adaptarse a la F vs datos δ en la región de post-contacto, z ≥ z _0, para el modelo de Hertz para extraer el módulo de Young, E de la célula:
   
   , Donde v es la relación de Poisson.
   Nota: Cuando δ es más de 10% del espesor de la muestra (altura de la celda), la rigidez de células medido se ve afectada por la rigidez del sustrato. El espesor de la región perinuclear es generalmente del orden de unos pocos micrómetros. Por lo tanto, sólo los primeros 200-300 nm de F-δ curva se ajustan al modelo de Hertz.

Resultados

La Figura 2a muestra tres curvas de fuerza representativas tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas en la superficie de plástico, gel de poliacrilamida de los módulos de Young 3000 Pa y 17.000 Pa, respectivamente. Después de identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, la fuerza de penetración en función de la deformación celular se representa en la Figura 2b. Bajo una fuerza de magnitud menor que 0,3 nN, una forma de pirámide guiones punta 3 micrómetros en un...

Discusión

El método de indentación AFM tiene ventajas para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas. Aunque menos sensible que la citometría de torsión magnético y pinzas ópticas, que puede medir fuerzas en el nivel picoNewton ^32, el AFM puede detectar la fuerza de resistencia de las muestras que van desde decenas de pico-Newton a cientos de nano-Newton, comparable a la gama de la fuerza que se puede aplicar a las células utilizando una micropipeta ^19. Este rango de la fuerza se ajusta a l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
microscopio de fuerza atómica	Asylum Research	MFP3D-BIO