Method Article

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

DOI:

10.3791/50521

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July 23rd, 2013

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1The College of Technology and Innovation, Center for Infectious Disease and Vaccinology, The Biodesign Institute, Arizona State University

In This Article

Summary

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Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene Agrobacterium tumefaciens En plantas para la expresión transitoria de proteínas.

Abstract

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Cultivo de células de mamíferos es la plataforma importante para la producción comercial de vacunas humanas y proteínas terapéuticas. Sin embargo, no puede satisfacer la creciente demanda mundial de productos farmacéuticos, debido a su limitada capacidad de ampliación y alto costo. Las plantas han demostrado ser una de las plataformas de producción farmacéuticas alternativas más prometedoras que son robustas, escalable, de bajo coste y seguro. El reciente desarrollo de vectores basados ​​en virus ha permitido la expresión transitoria rápida y de alto nivel de proteínas recombinantes en plantas. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, se demuestra una metodología simple, eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en tejido de la planta en este estudio. Nuestros resultados indican que tanto agroinfiltración con jeringa de vacío y métodos han dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas y de producción robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed. Por otra parte,demostramos las ventajas únicas que ofrece por ambos métodos. Infiltración de jeringa es simple y no necesita un equipo costoso. También permite la flexibilidad para infiltrarse ya sea toda la licencia con un solo gen diana, o para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. Por lo tanto, se puede utilizar para la expresión a escala de laboratorio de proteínas recombinantes, así como para la comparación de diferentes proteínas o vectores de rendimiento o expresión cinética. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también sugiere su utilidad en la escuela secundaria y la educación universitaria para el tema de la biotecnología. Por el contrario, la infiltración de vacío es más robusto y puede ser mayor escala para la fabricación comercial de proteínas farmacéuticas. También ofrece la ventaja de ser capaz de agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa como la lechuga y Arabidopsis. En general, la combinación de jeringa y agroinfiltración de vacío proporciona a los investigadores y educadores un simple, eficiente y robustometodología para la expresión de proteína transitoria. Además, facilitará en gran medida el desarrollo de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.

Introduction

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Desde la década de 1970, las plantas han sido explorados como alternativas a los cultivos de células de mamíferos, insectos, y bacteriana para la producción comercial de proteínas recombinantes y proteínas terapéuticas 1. Sistemas a base de plantas para la expresión de los productos biofarmacéuticos han demostrado ser prometedores en los últimos años varios nuevos tratamientos para enfermedades, como la enfermedad de Gaucher 2, y la gripe aviar H5N1 3, han demostrado tener éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo de mecanismos competentes para la expresión de proteínas recombinantes en plantas en las décadas desde los primeros exp....

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Protocol

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1. Crecimiento de las Plantas

  1. Lugar 60 pastillas de turba en una bandeja de propagación. Añadir 4 L de agua del grifo y dejar que la turba pellets de absorber el agua durante 2 horas.
  2. Añadir 2 N. benthamiana semillas en cada una turba de pellets con una sembradora, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico transparente, y les permiten germinar en un C Humedad ambiente 25 °, el 84% con un ciclo día / noche de 16/8 horas (Figura 1).
  3. Retire el domo dos semanas después de la siembra, drenar el agua de la bandeja, y añadir 2 litros de fertilizante de Jack a una concentración de 1,48 g / L (Figura 1B).

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Results

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1. Expresión de proteínas fluorescentes por infiltración Jeringa

Para demostrar la eficacia de la jeringa de la infiltración de Agrobacterium en el tejido de la planta, se probó la expresión de dos proteínas fluorescentes - GFP y DsRed - por dos vectores diferentes deconstruido de plantas virales - geminiviral y magnICON - en N. benthamiana. Por N. benthamiana hojas que fueron totalmente infiltrados con vectores que contienen geminiviral Agrobacteria, se obse.......

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Discussion

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La creciente demanda de productos farmacéuticos basados ​​en proteínas en todo el mundo requieren de nuevas plataformas de producción que son robustas, escalables y de bajo costo y seguro. Las plantas han demostrado ser uno de los sistemas de producción alternativas más prometedoras para la producción de la proteína farmacéutica. En los últimos años, el desarrollo de vectores basados ​​en virus deconstruido ha permitido la expresión transitoria de proteínas en plantas, lo que mejora en gran medida la velocidad y el rend.......

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Disclosures

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgements

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Agradecemos a R. Sun y otros estudiantes de laboratorio de Chen por su contribución a la generación de plantar material. También agradecemos al Dr. D. Green por su apoyo a la investigación universitaria en la Facultad de Tecnología e Innovación (CTI). Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones del NIH U01 AI075549 y 1R21AI101329 al P. Chen, y una donación de SSE de CTI, de la Universidad del Estado de Arizona a Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado y J. Stahnke son estudiantes universitarios apoyados por la concesión SSE.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
GFP InvitrogenV353-20www.invitrogen.com Ver referencia: Lico y Chen, et al 2008
DsRedClontech632152www.clontech.com Ver referencia: Baird y Zacharias, et al 2000
MagnICON VectorIcon Geneticsn/awww.icongenetics.com Ver referencia: giritch y Marillonnet, et al 2006
GeminiviralVector Author' s Labn/aVer referencia: Chen y He, et al 2011
N. benthamianaAutor' s Labn/aherbalistics.com.au
Agrobacterium tumefaciens cepa gv3101Autor' s Labn/aVer referencia: Lai y Chen 2012
LB Agar Carbenicillin-100, placasSigmaL0418www.sigmaaldrich.com
LB Agar Kanamycin-50, placasSigmaL0543www.sigmaaldrich.com
Sulfato de magnesio hidrato de hepaSigmaM2773-500 gwww.sigmaaldrich.com
Bacto-TriptonaFisher73049-73-7www.fishersci.com
Bacto Extracto de LevaduraBecton, Dickinson CO.REF 212750www.bd.com
Difco Caldo de nutrientesBecton, Dickinson CO.REF 234000www.bd.com
MES hydrate BufferSigmaM8250-1kgwww.sigmaaldrich.com
CarbenicillinSigmaC1613-1MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com
KanamycinSigma70560-51-9www.sigmaaldrich.com
Hidróxido de SodioSigma221465www.sigmaaldrich.com
Jack' s FertilizanteHummert InternationalJul-25www.hummert.com
Equipment
Vacuubrand MD4 Bomba de vacíoFisher13-878-113www.fishersci.com
Aire de vacío Válvula reguladoraFisherNC9386590www.fishersci.com
Desecador 12 1/8" con junta tóricaFisher08-594-15Cwww.fishersci.com
3 L TubRubber-Maidn/aRubbermaid Servn' Tazón Ahorrador, 10 tazas funcionará
plato/estante 230MLFisherNC9489269www.fishersci.com
Peat PelletHummert International14-2370-1www.hummert.com
>Bandeja de propagación Hidrogranjade cúpula132052www.hydroponics.net
Propagaiton Trayhydrofarm138758www.hydroponics.net
Virbo Hand SeederGro-Mor INCn/awww.gro-morent.com
Flora Carro 4 estantesHummert International65-6924-1www.hummert.com
15 ml Tubos de cultivo de fondo redondoSigmaCLS430172-500EAa href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com
EspectrofotómetroBio-Rad170-2525www.bio-rad.com
Espectrofotómetro CubetasBio-Rad223-9950www.bio-rad.com
Tubos de microcentrífugaUSA Scientific1415-2500www.usascientific.com
Centrífuga de sobremesaBio-Rad166-0602EDUa href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com
Incubadora/AgitadoraEppendorfExcella E25 www.eppendorf.com
Modelo de luz ultravioleta#: UVGL-25UVP95-0021-12www.uvp.com
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References

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  1. Chen, Q. Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).
  2. Chen, Q., Lai, H. Plant-derived virus-like particles as vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).<....

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AgroinfiltrationTransient ExpressionRecombinant ProteinsSyringe InfiltrationVacuum InfiltrationPlant BiotechnologyGFP ExpressionDsRed ExpressionAgrobacterium CulturePlant Transformation

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