La In ovo Membrana corioalantoidea (CAM) se injerta con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y estableció líneas celulares de sarcoma etiqueta fluorescente permanentes y transitorios. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento.
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Resumen
Resumen
El sarcoma es una enfermedad muy rara que es de naturaleza heterogénea, todos obstaculicen el desarrollo de nuevos tratamientos. Pacientes con sarcomas son candidatos ideales para la medicina personalizada después de la estratificación, que explica el interés actual en el desarrollo de un modelo de xenotrasplante reproducible y de bajo costo para esta enfermedad. La membrana corioalantoidea de pollo es un anfitrión inmunodeficiente natural capaz de sostener los tejidos y las células injertadas sin restricciones específicas de la especie. Además, es de fácil acceso, manipulado y fotografiado usando microscopía estereoscópica óptica y de fluorescencia. Histología permite un análisis más detallado de las interacciones celulares heterotípicos.
Este protocolo se describe en detalle la in ovo de injerto de la membrana corioalantoidea con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y la etiqueta fluorescente establecidos líneas celulares de sarcoma permanentes y transitorios (Saos-2 y SW1353). La rata de supervivencia de los pollueloses son hasta un 75%. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento. Para localizada injerto de suspensiones de células individuales, ECM gel proporciona ventajas significativas sobre los materiales inertes de contención. El índice de proliferación Ki67 se relaciona con la distancia de las células de la superficie de la CAM y la duración de la aplicación sobre la CAM, este último la determinación de un marco de tiempo para la adición de productos terapéuticos.
Introducción
El sarcoma es un tumor poco frecuente de los tejidos conectivos con una alta mortalidad por 1,2 resistencia a la terapia. El progreso en la supervivencia del paciente se ve obstaculizada por su baja incidencia anual, su amplia diversidad, y el hecho de que las células del sarcoma son reportados a ser difícil de cultivo in vitro 3,4.
El uso de células cultivadas para la evaluación de la terapia preclínica ha puesto de manifiesto que, aparentemente nuevas moléculas activas in vitro no siempre reflejan los resultados en el entorno clínico. Por otra parte, las aberraciones del genoma reveladas por las m....
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Protocolo
Ver Figura 1 para una visión general
Material tumoral
1. Obtención y preparación de las muestras tumorales
Para el uso de material del paciente, es necesario la aprobación del Comité de Ética y consentimiento informado tiene que ser obtenida del paciente.
- Material de cosecha representante (mínimo 1 cm 3) en el momento de la intervención, ya sea una biopsia o una resección de un sarcoma. El lugar adecuado de la biopsia se define utilizando dinámica de contraste de resonancia magnética.
- Coloque el material inmediatamente en un vial estéri....
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Resultados
Evaluación de la CAM
Injertos tumorales se vuelven adherentes a la CAM (Figura 2A). Suspensiones de células individuales de material del paciente con frecuencia muestran una placa ligeramente elevada seca (Figura 2D). Después de la escisión de la CAM, marcada arrugamiento de la membrana se produce (Figuras 2E y 2F).
Para las líneas celulares comerciales la placa se hace más opaca en el tiempo, lo qu.......
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Discusión
Tiempo de la inoculación y la cosecha
Medir el tiempo del día de la inoculación se realizó utilizando SAOS2 en gel de ECM (36 CAMs) y varió entre el desarrollo embrionario días 5 y 10.
Antes del día 9 de incubación, la CAM no fue siempre lo suficientemente grande para sostener el gel ECM se aplicó. En la cosecha, las células tumorales a veces tenían que ser recuperados de la CAM más profundo, y algunas muestras de gel ECM yacían sueltos en la albúmina o en la CAM. L.......
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Divulgaciones
Los autores tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Las células de la línea celular de condrosarcoma SW1353 fueron amablemente proporcionados por el Prof. Dr. PCW Hogendoorn y el Prof. Dr. J. Bovée de la Universidad de Leiden, Países Bajos. Damos las gracias a J. Mestach y G. Wagemans excelente para la asistencia técnica y G. De Bruyne para el dibujo profesional de la información general de nuestro protocolo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de nucleofactor de línea celular V | Amaxa | VCA-1003 | |
| solución de colagenasa 2 (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| anticuerpo monoclonal primario de ratón Ki67 | Dako Dinamarca | MIB-1 | |
| Paraformaldehído | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| vector peGFP-C1 | Clontech | 632470 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Solución de tripsina-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant marcaje celular DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Contador de células automatizado | Invitrogen | C10227 | |
| cámara digital a color | Leica | DFC 340 FX | |
| Incubadora digital de huevos | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Disociador Gentlemacs | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Manual del usuario del disociador Gentlemacs que contiene h_tumor protocolo | Miltenyi Biotech | ||
| [header] | |||
| película adhesiva semipermeable (Suprasorb F) | Lohmann& Microscopio de fluorescencia estereoscópica Rauscher | 20468 | |
| Leica | M205 FA | ||
| Tissue-Tek Film Cubreobjetos automatizado | Sakura | 6400 | |
| ultraView Kit de detección de DAB universal | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
Referencias
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al.
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Reimpresiones y permisos
