La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en un In vivo Contexto. La tinción por inmunofluorescencia para visualizar con precisión el plexo vascular es crucial para el éxito de estos tipos de estudios.
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Artículo de método
Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis
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Resumen
Resumen
La angiogénesis es el proceso complejo de la nueva formación de vasos sanguíneos definido por el surgimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes. La angiogénesis juega un papel clave no sólo en el desarrollo normal de los órganos y tejidos, pero también en muchas enfermedades en las que la formación de los vasos sanguíneos es mal regulada, tales como el cáncer, la ceguera y enfermedades isquémicas. En la vida adulta, los vasos sanguíneos son generalmente de reposo para la angiogénesis es un importante objetivo para el desarrollo de fármacos novedoso para tratar de regular la formación de nuevos vasos específicamente en la enfermedad. Con el fin de entender mejor la angiogénesis y para desarrollar estrategias apropiadas para regularlo, se requieren modelos que reflejan con precisión los diferentes pasos biológicos que están involucrados. La retina del ratón neonatal proporciona un excelente modelo de la angiogénesis debido a arterias, venas y capilares desarrollan para formar un plexo vascular durante la primera semana después del nacimiento. Este modelo también tiene la ventaja de tener una de dos diestructura dimensional (2D) hacer análisis simple en comparación con la compleja anatomía 3D de otras redes vasculares. Mediante el análisis del plexo vascular de la retina en diferentes momentos después del nacimiento, es posible observar las diversas etapas de la angiogénesis bajo el microscopio. Este artículo muestra un procedimiento sencillo para el análisis de la vasculatura de la retina del ratón usando tinción fluorescente con anticuerpos específicos isolectina y vasculares.
Introducción
La angiogénesis es un proceso de desarrollo complejo definido por la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes y está regulada por varias vías de señalización. La más destacada de éstas es la vía del VEGF. VEGF es liberada por las células isquémicas y conduce a la iniciación de brotes angiogénicos en los vasos sanguíneos vecinos. La célula endotelial líder de un nuevo brote vascular es una célula de 'punta', que produce filopodios que alcanzan hacia fuera hacia la fuente de VEGF, y es seguida por la proliferación de células endoteliales 'tallo'. De esta manera, las células endoteliales activadas migran y proliferan hacia una región avascular, donde forman nuevos tubos vasculares. Con el fin de estabilizar estos tubos para apoyar el flujo de sangre, las células endoteliales interactúan con los pericitos y células musculares lisas, que rodean los vasos sanguíneos nuevos 1. La angiogénesis es esencial para la vascularización del embrión y tejidos en crecimiento. Sin embargo, también contribuye a muchos patológicatrastornos de cal como el cáncer; mientras que defectos en la angiogénesis están asociados con enfermedades isquémicas. Por consiguiente, el desarrollo de tratamientos farmacológicos eficaces para regular la angiogénesis como un medio de tratamiento de la enfermedad es de gran interés. Por ejemplo, los factores anti-angiogénicos eficaces reducirán el crecimiento del cáncer, mientras que las estrategias de pro-angiogénicos pueden ser usados para tratar la enfermedad isquémica. Por lo tanto, los modelos de angiogénesis son esenciales para entender mejor la regulación de la formación de nuevos vasos y para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar o disminuir el crecimiento vascular.
Un elemento fundamental de la investigación de la angiogénesis es la elección de un modelo vascular apropiada. Muchos en modelos in vitro se han diseñado para reproducir los pasos básicos de la angiogénesis tales como la migración de células endoteliales, proliferación y supervivencia 2,3. A utilizado con frecuencia en el ensayo in vitro es la formación de una red ramificada de células endoteliales sobre una matriz de Matrigel, aunque tla suya no es específico de las células endoteliales, ni tampoco suelen incorporar el apoyo de los pericitos o células del músculo liso. Evaluación ex vivo de la angiogénesis brotación usando cultivo de órganos de ratón, tales como el ensayo de cuerpo embrioide, el ensayo de anillo aórtico y el ensayo metatarsiano fetal permite el análisis de la angiogénesis de las células endoteliales en el contexto de células de soporte adicionales. Sin embargo, las principales limitaciones de estos ensayos incluyen la falta de flujo de sangre y la regresión de los vasos a través del tiempo, dando una ventana limitada para el análisis. Por lo tanto, para comprender la regulación de la angiogénesis con mayor precisión, en modelos in vivo son necesarios tales como los desarrollados en el ratón utilizando esponjas implantadas por vía subcutánea o tapones de matrigel, así como el modelo de isquemia de las extremidades posteriores. Sin embargo, estos modelos son difíciles de analizar debido a la compleja arquitectura 3D de los neovasos. En contraste, el embrión de pez cebra ha demostrado ser un excelente modelo para la visualización de la angiogénesis en el conjuntoorganismo 4. Sin embargo, el ratón es evolutivamente mucho más estrechamente relacionada con la humana que pez cebra, haciendo que el ratón un modelo preferido en muchos casos. Por consiguiente la angiogénesis de la retina del ratón postnatal representa un método bien caracterizado de elección para la investigación angiogénesis. No sólo proporciona un entorno fisiológico, pero también un plexo vascular 2D que puede ser fácilmente visualizado utilizando manchas fluorescentes apropiados. La arquitectura de la red de vasos, la proliferación endotelial, germinación, reclutamiento de células perivasculares y remodelado vascular todo puede ser investigada utilizando esta técnica.
En la retina del ratón neonatal, el desarrollo de los vasos sanguíneos de la retina se produce en la primera semana de vida postnatal. Los ratones, a diferencia de los humanos, nacen ciegos y las retinas sólo son vascularizados después del nacimiento. Surgen vasos de la retina desde el centro de la retina cerca del nervio óptico en el día postnatal 0 (P0), y se desarrollan por la angiogénesis para formar un altamente organizard plexo vascular que llega a la periferia de la retina en aproximadamente 5 P8. Los vasos sanguíneos se desarrollan de una manera característica con el plexo capilar creciente gradualmente hacia fuera desde el disco óptico hacia la periferia para generar un modelo de alternancia regular de las arterias y venas con una red capilar intervenir. La vasculatura de la retina proporciona un modelo ideal para estudiar la angiogénesis como los vasos se pueden identificar fácilmente a medida que crecen en lo que es esencialmente un plano 2D, por lo que es relativamente fácil de examinar la vasculatura de la retina en los preparativos de montaje plana 5. Un método para el aislamiento de la retina del ratón neonatal para el análisis de las respuestas de células endoteliales punta durante varias horas ex vivo ha sido reportado 6. Alternativamente, una investigación más detallada de toda la vasculatura de la retina y de los marcadores vasculares asociadas requiere la inmunotinción de muestras de retina fijos en diferentes etapas de desarrollo.
Aquí proporcionamosuna descripción detallada de un método fiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción de todo el montaje de la retina plexo vascular murino, de la enucleación del ojo inicial postnatal (ver también 7) a través de los protocolos de tinción a la imagen final bajo el microscopio.
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Protocolo
Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
1. Enucleación y Fijación de postnatal Eyes
- Coloque el ratón sacrifique a las crías en su lado, quitar la piel que cubre el ojo con unas tijeras.
- Con unas tijeras y pinzas para enucleación del ojo.
- Coloque las tijeras por debajo del ojo enucleado, cortar el nervio óptico y los tejidos circundantes y levantar la vista. Transferencia a una placa de 24 pocillos que contenía 4% de paraformaldehído (PFA) formado por 2x en PBS a temperatura ambiente.
- Permita que cada ojo para fijar por 10 - 15 min, luego traslado al frío 2x PBS en hielo durante 5 - 10 min. Es mejor escalonar enucleaciones y la posterior fijación para asegurar el grado de fijación es igual para cada ojo.
2. Disección de retinas murinos postnatales
- Transferencia de los ojos en una placa de Petri que contiene 2x PBS utilizando una pipeta Pasteur de plástico que se ha cortado para ensanchar el agujero y colocar en Dissección de microscopio.
- Retire toda la grasa alrededor de los ojos con unas pinzas y tijeras.
- Pierce el borde de la córnea con tijeras y cortar alrededor de la córnea y el iris y el descarte.
- Inserte pinzas entre la retina y la esclerótica y retire la esclerótica con cuidado de no romper la retina. La capa de la coroides también se puede quitar, pero si hay un riesgo de daño a la retina que ocurre durante este paso, la capa de la coroides se puede dejar en, ya que no debería afectar significativamente la calidad de la inmunotinción.
- Retire la lente y el humor vítreo utilizando pinzas.
- Retire los recipientes hialoides por reuniéndolos en el centro de la atención con unas pinzas finas y luego tire rápidamente lejos del centro de la retina (como alternativa tijeretazo en la base de los vasos hyaloid con tijeras finas).
- Enjuague la retina en forma de copa con PBS en una placa de Petri limpia.
- Hacer 4 a 5 incisiones radiales que alcanzan aproximadamente 2/3 del radio de la retina utilizando primavera scissors para crear una forma de "pétalo".
- Extraiga PBS utilizando una pipeta Pasteur para aplanar la retina y, a continuación, eliminar el exceso de PBS con un pequeño trozo de papel absorbente.
- Lentamente pipeta frío (-20 ° C) metanol gota a gota sobre la superficie de la retina hasta totalmente cubierto y luego inundación con metanol adicional. Esto le ayudará a fijar las retinas y facilitará la permeabilización. Las retinas se volverá blanco.
- Transferir a un tubo de 2 ml utilizando una pipeta Pasteur de plástico que ha sido cortado para ensanchar el orificio.
- Agregar la retina en metanol frío durante al menos 20 min antes de proceder con la inmunotinción. De los anticuerpos utilizados aquí, sólo la VE-cadherina no puede ser utilizado con éxito en las retinas fijadas con metanol. En este caso retinas deben proceder directamente a inmunotinción después del paso 9.
- Si es necesario, las retinas se puede almacenar en metanol a -20 ° C durante hasta varios meses antes de la tinción.
3. Immuno / isolectina tinción de la retina Vasculatura
- Retire cuidadosamente / verter el metanol y enjuagar suavemente retinas brevemente en PBS (en esta etapa de la retina se encuentra todavía en el mismo tubo de 2 ml de la etapa 11 anterior).
- Retire PBS y retinas de cobertura con 100 l de solución de Perm / Block (PBS + 0,3% Triton + 0,2% de BSA) + 5% de suero adecuado (vea la Tabla 1) y agite suavemente durante 1 hora.
- Retire Perm / Bloquear e incubar retinas con agitación suave durante la noche a 4 ° C con 100 l de anticuerpos primarios seleccionados (véase la Tabla 1) y / o IsolectinB4, todo preparada diluyendo en Perm / Bloquear.
- Retire anticuerpo / isolectina y lavar retinas 4 x 10 min en PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
- En algunos casos, por ejemplo, después de la tinción con IsolectinB4-Alexa488 o un anticuerpo primario conjugado directamente, no es necesario un anticuerpo secundario y las retinas se puede montar directamente (paso 7). Cuando un anticuerpo primario sin conjugar se ha utilizado en el paso 3, a continuación 100 l de la fluor apropiadoSe añade anticuerpo secundario escent (diluido 1/200 en PBSTx) y se deja incubar durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente.
- Retire anticuerpo secundario y lavar retinas 4 x 15 min en 2 ml PBSTx.
- Traslado retinas en portaobjetos utilizando una amplia perforación de plástico pipeta Pasteur y eliminar el exceso PBSTx con el tejido absorbente. Mount retinas por la adición de 50 l de prolongar medio de montaje sobre un portaobjetos y coloque suavemente sobre la retina.
- Transferencia desliza a refrigerador durante la noche a 4 º C, asegurando que son planas y protegido de la luz, para que el medio de montaje Prolongar para ajustar.
- Imagen retina utilizando un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia.
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Resultados
Después de la disección de la retina debe ser similar a una flor plana (Figura 1). Al utilizar el protocolo, descrito anteriormente, las células endoteliales se pueden ver mediante la tinción de B4-isolectina Alexa488 y el apoyo a las células musculares vasculares se visualizaron utilizando actina de músculo liso anti-alfa (Figura 2). El punto de vista de baja potencia utilizando un objetivo de 5X en la Figura 2 permite una visión general de la organización vascular de ...
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Discusión
El método presentado aquí ofrece una manera sencilla y eficaz para obtener imágenes de las preparaciones de todo el montaje manchadas de retinas de ratones neonatales, por lo que es un modelo fácilmente cuantificables y fisiológicamente relevantes de la angiogénesis. Inicialmente, el ojo del ratón puede ser muy difícil de diseccionar debido a su pequeño tamaño y la forma de globo, por lo que un poco de práctica y las buenas herramientas de disección son necesarias para obtener resultados fiables. La disección de los ojo...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust y la Fundación Británica del Corazón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Pipetas de plástico 3 ml | Suministros de Laboratorio Científico | PIP4210 | Retire la punta con unas tijeras para crear un diámetro interior ancho |
| Placas BD Falcon de 24 pocillos | Suministros de laboratorio científico | 353226 | |
| Seleccionar placas de Petri TV | Suministros de laboratorio científico | SLS2002 | |
| portaobjetos Histobond | VWR | 631-0624 | |
| Cubreobjetos 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Pinzas Dumont #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Tijeras de muelle de 10,5 cm de largo, con hojas rectas de 8 mm | World precision instruments | 501235 | Utilizado para la enucleación |
| Tijeras Vannas de 8,5 cm de largo, con hojas rectas de 7 mm y puntas superfinas de 0,025 x 0,015 mm | Instrumentos de precisión del mundo | 500086 | Se utiliza para la disección de retina |
| Tijeras de vannas superfinas de 8 cm de largo con hojas rectas de 3 mm y puntas superfinas de 0,015 x 0,015 mm | Instrumentos de precisión del mundo | 501778 | Se utiliza para la disección de retina |
| cristalina’ tubos de 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reactivos | |||
| fosfato de sodio dibásico | Sigma | S0876 | reactivo PBS |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma | P5655 | Reactivo PBS |
| Cloruro de sodio | Sigma | S9625 | Reactivo |
| PBS Paraformaldehído Sigma | P6148 | Envasar en 2x PBS y almacenar a -20 ° C | |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Suero de burro | Sigma | D9663 | |
| Suero de cabra | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold reactivo antidecoloración | Invitrogen | P36930 | Reactivo de montaje |
| Isolectina GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Úselo en Dilución 1:200 |
| Isolectina GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Uso con dilución 1:200 |
| Primary AntibodiesAnti-NG2 (policlonal de conejo)Millipore AB5320 Detecta pericitos Anti-GFAP (clon GA5, monoclonal de ratón)Millipore MAB360 Detecta astrocitos Anti-Desmin (clon Y66, | |||
| monoclonal de conejo) | Millipore | 04-585 | Detecta pericitos |
| Anti-Colágeno IV (policlonal de conejo) | Chemicon | AB756P | Detecta la membrana basal vascular |
| Anti-alfa músculo liso actina-Cy3 (clon 1A4, monoclonal de ratón) | Sigma | C6198 | Detecta células del músculo liso vascular. |
| Anti-Endoglin (clon MJ7/18, monoclonal de rata) | BD Pharmingen | 550546 | Detecta células endoteliales |
| Anti-CD31 (clon MEC13.3, monoclonal de rata) | BD Pharmingen | 553370 | Detecta células endoteliales |
| Anti-VE-Cadherin (clon 11D4.1, monoclonal de rata) | BD Pharmingen | 550548 | Detecta uniones de células endoteliales |
| Anti-Alk1 (policlonal de cabra) | R& D Systems | AF770 | Detecta células endoteliales |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C. |
| Anti-rata de cabra-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C. |
| Anti-rata de cabra-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C. |
| Cabra anti-ratón-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a la llegada y se almacenan a -20 °C. |
| Burro anti-cabra-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C. |
| fuerte | |||
| Microscopio de disección | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Cámara para microscopio de disección | |||
| Microscopio epifluorescente | Zeiss | Axioimager con cámara Apotome | |
| Cámara Zeiss | Axiocam HRm | Axioimager | |
| Nikon | A1R | ||
Referencias
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Reimpresiones y permisos
