Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Resumen

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en un In vivo Contexto. La tinción por inmunofluorescencia para visualizar con precisión el plexo vascular es crucial para el éxito de estos tipos de estudios.

Resumen

La angiogénesis es el proceso complejo de la nueva formación de vasos sanguíneos definido por el surgimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes. La angiogénesis juega un papel clave no sólo en el desarrollo normal de los órganos y tejidos, pero también en muchas enfermedades en las que la formación de los vasos sanguíneos es mal regulada, tales como el cáncer, la ceguera y enfermedades isquémicas. En la vida adulta, los vasos sanguíneos son generalmente de reposo para la angiogénesis es un importante objetivo para el desarrollo de fármacos novedoso para tratar de regular la formación de nuevos vasos específicamente en la enfermedad. Con el fin de entender mejor la angiogénesis y para desarrollar estrategias apropiadas para regularlo, se requieren modelos que reflejan con precisión los diferentes pasos biológicos que están involucrados. La retina del ratón neonatal proporciona un excelente modelo de la angiogénesis debido a arterias, venas y capilares desarrollan para formar un plexo vascular durante la primera semana después del nacimiento. Este modelo también tiene la ventaja de tener una de dos diestructura dimensional (2D) hacer análisis simple en comparación con la compleja anatomía 3D de otras redes vasculares. Mediante el análisis del plexo vascular de la retina en diferentes momentos después del nacimiento, es posible observar las diversas etapas de la angiogénesis bajo el microscopio. Este artículo muestra un procedimiento sencillo para el análisis de la vasculatura de la retina del ratón usando tinción fluorescente con anticuerpos específicos isolectina y vasculares.

Introducción

La angiogénesis es un proceso de desarrollo complejo definido por la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes y está regulada por varias vías de señalización. La más destacada de éstas es la vía del VEGF. VEGF es liberada por las células isquémicas y conduce a la iniciación de brotes angiogénicos en los vasos sanguíneos vecinos. La célula endotelial líder de un nuevo brote vascular es una célula de 'punta', que produce filopodios que alcanzan hacia fuera hacia la fuente de VEGF, y es seguida por la proliferación de células endoteliales 'tallo'. De esta manera, las células endoteliales activadas migran y prolifer....

Protocolo

Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.

1. Enucleación y Fijación de postnatal Eyes

1. Coloque el ratón sacrifique a las crías en su lado, quitar la piel que cubre el ojo con unas tijeras.
2. Con unas tijeras y pinzas para enucleación del ojo.
3. Coloque las tijeras por debajo del ojo enucleado, cortar el nervio óptico y los tejidos circundantes y levantar la vista. Transferencia a una placa de 24 pocillos que contenía 4% de paraformaldehído (PFA) formado por 2x en PBS a temperatura ambiente.
4. Permita que cada ojo para fijar por 10 - 15 min, luego traslado ....

Resultados

Después de la disección de la retina debe ser similar a una flor plana (Figura 1). Al utilizar el protocolo, descrito anteriormente, las células endoteliales se pueden ver mediante la tinción de B4-isolectina Alexa488 y el apoyo a las células musculares vasculares se visualizaron utilizando actina de músculo liso anti-alfa (Figura 2). El punto de vista de baja potencia utilizando un objetivo de 5X en la Figura 2 permite una visión general de la organización vascular de .......

Discusión

El método presentado aquí ofrece una manera sencilla y eficaz para obtener imágenes de las preparaciones de todo el montaje manchadas de retinas de ratones neonatales, por lo que es un modelo fácilmente cuantificables y fisiológicamente relevantes de la angiogénesis. Inicialmente, el ojo del ratón puede ser muy difícil de diseccionar debido a su pequeño tamaño y la forma de globo, por lo que un poco de práctica y las buenas herramientas de disección son necesarias para obtener resultados fiables. La disección de los ojo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material
Pipetas de plástico 3 ml	Suministros de Laboratorio Científico	PIP4210	Retire la punta con unas tijeras para crear un diámetro interior ancho
Placas BD Falcon de 24 pocillos	Suministros de laboratorio científico	353226
Seleccionar placas de Petri TV	Suministros de laboratorio científico	SLS2002
portaobjetos Histobond	VWR	631-0624
Cubreobjetos 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Pinzas Dumont #5	World precision instruments	14095
Tijeras de muelle de 10,5 cm de largo, con hojas rectas de 8 mm	World precision instruments	501235	Utilizado para la enucleación
Tijeras Vannas de 8,5 cm de largo, con hojas rectas de 7 mm y puntas superfinas de 0,025 x 0,015 mm	Instrumentos de precisión del mundo	500086	Se utiliza para la disección de retina
Tijeras de vannas superfinas de 8 cm de largo con hojas rectas de 3 mm y puntas superfinas de 0,015 x 0,015 mm	Instrumentos de precisión del mundo	501778	Se utiliza para la disección de retina
cristalina’ tubos de 2 ml	Starlab	E1420-2000
Reactivos
fosfato de sodio dibásico	Sigma	S0876	reactivo PBS
Fosfato de potasio monobásico	Sigma	P5655	Reactivo PBS
Cloruro de sodio	Sigma	S9625	Reactivo
PBS Paraformaldehído Sigma		P6148	Envasar en 2x PBS y almacenar a -20 ° C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Suero de burro	Sigma	D9663
Suero de cabra	Vector	S-1000
Prolong Gold reactivo antidecoloración	Invitrogen	P36930	Reactivo de montaje
Isolectina GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Úselo en Dilución 1:200
Isolectina GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Uso con dilución 1:200
Primary AntibodiesAnti-NG2 (policlonal de conejo)Millipore AB5320 Detecta pericitos Anti-GFAP (clon GA5, monoclonal de ratón)Millipore MAB360 Detecta astrocitos Anti-Desmin (clon Y66,
monoclonal de conejo)	Millipore	04-585	Detecta pericitos
Anti-Colágeno IV (policlonal de conejo)	Chemicon	AB756P	Detecta la membrana basal vascular
Anti-alfa músculo liso actina-Cy3 (clon 1A4, monoclonal de ratón)	Sigma	C6198	Detecta células del músculo liso vascular.
Anti-Endoglin (clon MJ7/18, monoclonal de rata)	BD Pharmingen	550546	Detecta células endoteliales
Anti-CD31 (clon MEC13.3, monoclonal de rata)	BD Pharmingen	553370	Detecta células endoteliales
Anti-VE-Cadherin (clon 11D4.1, monoclonal de rata)	BD Pharmingen	550548	Detecta uniones de células endoteliales
Anti-Alk1 (policlonal de cabra)	R& D Systems	AF770	Detecta células endoteliales
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C.
Anti-rata de cabra-Alexa488	Invitrogen	A11006	Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C.
Anti-rata de cabra-Alexa594	Invitrogen	A11007	Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C.
Cabra anti-ratón-Alexa488	Invitrogen	A11029	Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a la llegada y se almacenan a -20 °C.
Burro anti-cabra-Alexa594	Invitrogen	A11058	Todos los anticuerpos secundarios se alícuota inmediatamente a su llegada y se almacenan a -20 °C.
fuerte
Microscopio de disección	Zeiss	Stemi SV6
			Cámara para microscopio de disección
Microscopio epifluorescente	Zeiss	Axioimager con cámara Apotome
	Cámara Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager
	Nikon	A1R

de 90 mm Cámara Zeiss Axiocam HRc para microscopio confocal