Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Resumen

Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.

Resumen

Aquí se describe un procedimiento para obtener imágenes de estructuras subcelulares en roedores vivos que se basa en el uso de microscopía intravital confocal. Como un modelo de órgano, utilizamos las glándulas salivales de ratones vivos, ya que proporcionan una serie de ventajas. En primer lugar, pueden ser fácilmente expuestos a permitir el acceso a la óptica, y se estabilizan para facilitar la reducción de los artefactos de movimiento debido a latido del corazón y la respiración. Esto facilita significativamente de formación de imágenes y el seguimiento de las pequeñas estructuras subcelulares. En segundo lugar, la mayor parte de las poblaciones de células de las glándulas salivales son accesibles desde la superficie del órgano. Esto permite el uso de microscopía confocal que tiene una resolución espacial más alta que otras técnicas que se han utilizado para la formación de imágenes in vivo, tales como la microscopía de dos fotones. Por último, las glándulas salivales pueden ser fácilmente manipulados genéticamente y farmacológicamente, proporcionando así un sistema robusto para investigar los procesos biológicos a nivel molecular.

En este estudio nos centramos en un protocolo diseñado para seguir la cinética de la exocitosis de los gránulos secretores de las células acinares y la dinámica de la membrana plasmática apical donde los gránulos de secreción se fusionan a la estimulación de los receptores beta-adrenérgicos. Específicamente, se utilizó un ratón transgénico que co-expresa GFP citosólica y un péptido membrana orientada fusionado con la proteína fluorescente tándem de tomate. Sin embargo, los procedimientos que utilizamos para estabilizar y la imagen de las glándulas salivales se pueden extender a otros modelos de ratón y acoplados a otros enfoques para etiquetar in vivo componentes celulares, lo que permite la visualización de varias estructuras subcelulares, tales como los endosomas, lisosomas, mitocondrias, y el citoesqueleto de actina.

Introducción

En las últimas dos décadas el advenimiento de la microscopía en vivo y el uso de proteínas fluorescentes han dado lugar a grandes avances en cada proceso celular imaginable, avanzando así en nuestra comprensión de la biología de las células ^1. Este campo se ha beneficiado enormemente de la utilización de cultivos de células de mamíferos que son sistemas modelo extremadamente potentes, en particular cuando se trata de manipulaciones experimentales. Sin embargo, a menudo no proporcionan una verdadera representación de la biología de los organismos multicelulares complejos ^2. Este problema ha empezado a abordarse por el desarrollo de la microscopía....

Protocolo

Parte 1: Microscopio y preparación del programa de instalación de imágenes

1. Cualquier microscopio confocal invertido debe ser adecuado para IVM. En este estudio se utilizó un microscopio Olympus IX81 invertido, equipado con una unidad de Fluoview-1000 confocal de barrido láser. Para lograr la mejor solución posible, se recomienda el uso de altos objetivos de NA, como la inmersión en agua UPLSAPO 60x/1.20 NA, y el aceite de inmersión Plan-Apo 60x/1.42 NA. Objetivos de inmersión en aceite tienen eficiencias de recolección más altas y a pesar de que requieren el uso de un cubreobjetos entre el tejido y el objetivo, que proporcionan una mejor calidad de imagen ....

Resultados

En el ratón GFP / mTomato, los acinos aparecen como estructuras claramente diferentes, que expresan GFP citosólica y el péptido en tándem de tomate membrana orientada (Figura 2, línea de trazos). En acinos individual, las células acinares son delineados por el péptido en tándem de tomate. También se detectó GFP en los núcleos que son claramente visibles dentro de las células acinares (Figura 2, flechas). GFP citosólica se excluye de los gránulos secretores que aparecen vesículas circula.......

Discusión

Hasta ahora estructuras subcelulares han sido fotografiados en su mayoría en in vitro (es decir, los cultivos de células) o en ex vivo (es decir, las orga-culturas, rebanadas de tejidos, preparaciones acinares) sistemas de modelos que a menudo no recapitulan las características de los tejidos vivos intactos ^6. En este sentido, el enfoque presentado aquí representa un avance importante ya que permite imágenes de las dinámicas de un paso el tráfico de membrana específico (es decir, la.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo
Isofluorano (Forano)	Baxter	101936-40	Mango bajo capó químico
Ketamina (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Solución madre 100 mg/ml
Xilacina (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Solución madre 100 mg/ml
Neomicina/Polimixina B	Bausch y Lomb	24208-785-55	Úselo para lubricar el ojo del ratón
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Trietanolamina	Sigma-Aldrich	90279	Agregue gota a gota para evitar que la solución se solidifique
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	Prepare soluciones frescas en solución salina cuando sea necesario. Las existencias se pueden almacenar a -20 & grados; C
Instrument
Isoflurano V 1.9 (Vaporizador)	Braintree Scientific	190AF
Mesa de tiro descendente portátil equipada con filtro HEPA	Hazard Technology	PDDT
Lámpara de calor, modelo HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
Termómetro MicroTherma 2T	Braintree Scientific	TW2
Tijeras de operación (rectas de 11,5 cm	World Precision Instruments	5003708-12
#7	Microtijeras World Precision Instruments	14187
World	Precision Instruments	503365
Sutura de seda trenzada negra #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Esponjas de gasa 2" x 2"	Tyco Healthcare	9022
Pañuelo de limpieza de lentes	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476