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La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

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DOI:

10.3791/50568

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21 de agosto de 2013

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1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

En este artículo

Resumen

La actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 en células de cáncer sometidos a la mitosis se documentó en tiempo real por imagen confocal en vivo. 34 PJ-erradicar el cáncer de mama humano MDA-MB-231 células que albergan actividades extra-centrosomas en la mitosis. A diferencia de la mitosis bi-focal normal, las actividades extra-centrosomas no se agruparon en los dos polos del huso en la presencia de PJ-34.

Resumen

Derivados de fenantreno que actúan como potentes inhibidores PARP1 impidió la agrupación bi-focal de centrosomas supernumerarios en células humanas de cáncer de varios centrosomales en mitosis. El fenantridina PJ-34 era la molécula más potente. Desagrupación de actividades extra-centrosomas causa insuficiencia mitótico y la muerte celular en células multi-centrosomales. Cánceres humanos más sólidos tienen alta incidencia de extra-centrosomas. La actividad de PJ-34 se documentó en tiempo real, mediante formación de imágenes confocal de cáncer de mama humano en vivo las células MDA-MB-231 transfectadas con vectores que codifican para fluorescente γ-tubulina, que es muy abundante en los centrosomas y para fluorescente presente en la histona H2B los cromosomas. Arreglos de cromosomas aberrantes y de focos agrupados-γ-tubulina que representan centrosomas declustered se detectaron en las células transfectadas MDA-MB-231 después del tratamiento con PJ-34. Un-agrupados adicional-centrosomas en los dos polos del huso precedieron la muerte celular. Estos resultados vinculados FOr la primera vez que la actividad citotóxica exclusiva recientemente detectado de PJ-34 en células de cáncer humano con centrosomas adicional-de-la agrupación en la mitosis, y el fracaso mitótico que conduce a la muerte celular. De acuerdo con los resultados anteriores observados por microscopía confocal de células fijas, PJ-34 células de cáncer erradicado exclusivamente con múltiples centrosomas sin afectar las células normales en mitosis con dos centrosomas y cabezales bi-focal. Esta actividad citotóxica de PJ-34 no fue compartida por otros inhibidores potentes PARP1, y se observó en PARP1 deficientes extracentrosomes albergan MEF, lo que sugiere su independencia de la inhibición de PARP1. Vivir imagen confocal ofrecen una herramienta útil para la identificación de nuevas moléculas erradicar las células durante la mitosis.

Introducción

Fenantreno deriva inhibidores PARP1, incluyendo PJ-34, fueron diseñados para proteger a las células en reposo de la muerte celular apoptótica inducida por la energía que consume PARP1 mediada por reparación del ADN en condiciones de estrés (accidente cerebrovascular o infarto de miocardio) 1. Sin embargo, recientemente hemos descubierto que PJ-34, a dos veces mayor que la concentración que induce la inhibición PARP1, puede causar exclusivamente la muerte celular en células humanas de cáncer 2,3. Cuanto más rápida sea la proliferación de la célula era, más eficiente será la erradicación de las células era. La actividad citotóxica de PJ-34 se atribuyó a extra-centrosomas de-agrupación en la mitosis 2. Muchas células cancerosas puerto humana multicentrosomes 4,5. La incubación de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231, que albergan centrosomas supernumerarios, con 20 mM PJ-34 de manera eficiente erradicado estas células dentro de 72-96 horas sin perjudicar las células quiescentes o algunas células proliferantes benignas albergar dos centrosomas en la mitosis 2,3. Células benignas incluyen las células epiteliales mamarias humanas MCF-10, células endoteliales humanas (HUVEC) y las células mesenquimales primarios preparados a partir de timo humano. Estas células fueron resistentes a la actividad citotóxica de PJ-34. PJ-34 no interfirió con su ciclo celular durante 96 horas de incubación o afectan a sus centrosomas y la formación del huso bi-focal 2,3.

Montaje centrosoma bipolar es crucial para la formación del huso bipolar en la mitosis 4,5. Por lo tanto, las células con más de dos centrosomas han desarrollado un mecanismo molecular escasamente entendido, la agrupación de sus centrosomas adicionales en dos polos 4-9. El fallo de montaje bipolar de sus centrosomas puede causar multipolar distorsionada husillos y la segregación aberrante de cromosomas que las detenciones del ciclo celular en G2 / M detención, y conduce a la muerte celular atribuidos al fracaso mitótico 4,5. Los mecanismos moleculares que subyacen a centrosomas adicional-de-agrupación se investigaron intensamente 10. La comprensión de este mecanismo de la muerte permitirá la erradicación de la exclusiva de las células cancerosas sin dañar los tejidos sanos 5,10.

Por lo tanto, los compuestos que activan la muerte celular mitótica catástrofe ofrecen un nuevo modo de una terapia contra el cáncer selectiva, que puede ser eficaz en una amplia gama de resultados cancers.Our sólidos humanos sugieren que la imagen confocal se puede utilizar para identificar moléculas que afectan extra-centrosomas en la agrupación la mitosis 2,3, lo que hace estos compuestos cáncer de focalización candidatos de la droga.

Hemos documentado la actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 mediante el escaneo de las células cancerosas humanas fijadas y en vivo (con alta ocurrencia de adicional-centrosomas en la mitosis) frente a las células normales. Un paso a paso la descripción de los procedimientos de imagen utilizados para identificar la actividad citotóxica de PJ-34 en células de cáncer humano se incluye a continuación.

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Protocolo

1. Cultivo de células Preparación

Células MDA-MB-231 se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection) y se almacenan en nitrógeno líquido.

  1. Seed 10 6 MDA-MB-231 células en 92 mm de diámetro en una placa de Petri 10 ml de medio completo que contenía medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM), 10% de suero de caballo, 1% de L-glutamina, y 1% Penstrep-anfotericina B. Permiten a las células a proliferar a aproximadamente 80-100% de confluencia.
  2. Retire el medio de cultivo de plato y desechar.
  3. Se lava la capa de células brevemente con 0,25% (w / v) de solución de tripsina-EDTA para eliminar todas las trazas de suero.
  4. Añadir 2,0 ml de solución de tripsina-EDTA al plato y observar las células por microscopio invertido hasta que se dispersa capa de células (generalmente en el plazo de 5 a 15 min).
  5. Añadir 18 ml de medio de crecimiento completo y aspirar suavemente las células con una pipeta. Pasar a un tubo.
  6. Se centrifuga la suspensión celular a 1200 rpm.
  7. Vuelva a suspender el sedimento celular en 24 ml de culture medio.
  8. Añadir 2 ml de suspensión celular a 35 mm placas de fondo de cristal (alrededor del 25% de confluencia) y colocar en la incubadora (5% de CO2, 37 ° C).
  9. Soluciones:
    1. Medio completo para la proliferación de las células: DMEM con 10% de FBS, 1% de antibióticos (100 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de estreptomicina, solución de Pen-Strep-Ampho) y 2 mM de L-glutamina.
    2. Solución de tripsina-EDTA, que contiene 0,25% de tripsina-EDTA.
  10. Platos:
    92 placas de Petri mm de diámetro.
    35 mm de diámetro con fondo de vidrio recubiertos con placas de cultivo de poli-D-lisina.

2. Preparación de las células de la Imagen confocal en vivo

  1. Seed 2 x 10 5 células MDA-MB-231 células en placas de cultivo de fondo de cristal en 2 ml de medio completo que se mencionan en el apartado 1. Cuando el cultivo celular alcanza confluencia de 60-70% (cerca de 3-4 x 10 5 células por placa), proceda con la transfección.
  2. Transfectar las células con dos plásmidos codificadoresción las proteínas de fusión γ-tubulina-GFP (para la detección fluorescente de centrosomas) y la histona-ROJO (H2B-ROJO, para la detección fluorescente de los cromosomas) usando el reactivo de transfección liposomal Jet-PI, siguiendo el protocolo de fabricación. En pocas palabras, mezclar 2 g de cada plásmido en un tubo con 100 l de NaCl (150 mM). Mezclar el reactivo de transfección (100 l) con 100 l de NaCl (150 mM) en un segundo tubo, e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT). A continuación, combinar las dos soluciones, mezcla (utilizando vórtice leve) y girar hacia abajo. Incubar durante 30 min a TA.
  3. Durante la incubación de la mezcla de transfección, se lavan las células una vez con PBS y reemplazar el medio de las células con 2 ml de DMEM caliente sin suplementos (37 ° C).
  4. Añadir con cuidado la mezcla de transfección a las células en DMEM y luego volver a las células a la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 8 h.
  5. Después de 8 horas de incubación, reemplazar el DMEM con 2 ml de medio completo y se incuban las células en la incubadora durante 24hora
  6. 24 h después de la transfección, sustituir el medio de las células con 2 ml de medio completo que contenía 20 mM PJ-34.
  7. Se incuban las células durante 18 horas adicionales (37 ° C, 5% CO 2).
  8. Sujeto a las células para vivir imagen confocal durante al menos 16 horas en la cámara de imagen manteniendo las células en 5% de CO 2 y 37 ° C.
  9. Al mismo tiempo, examinar la eficacia de transfección 36 h después de la transfección utilizando microscopía de fluorescencia de la siguiente manera:
    1. Semilla 2 x 10 5 MDA-MB-231 células en placa de 6 pocillos que contiene 1 cubreobjetos por pocillo en 2 ml de medio completo.
    2. Transfectar las células como se ha mencionado en las secciones 2.2 a 2.5.
    3. 36 horas después de la transfección fijar las células transfectadas montados sobre un cubreobjetos de incubación en metanol frío: acetona (1:1), 7 min, 20 ° C.
    4. Aspirar la solución de fijación y dejar que el cubreobjetos con las células montadas a secar en una campana química.
    5. Aplicar ProLong antifade reactivo de oro con DAPI y dejar the portaobjetos se seque en la oscuridad durante 6 horas.
    6. Examinar el portaobjetos bajo el microscopio fluorescente y calcular el porcentaje de las células transfectadas (señales roja y verde) de la población total de células (tinción de ADN por DAPI). El porcentaje de transfección deseada es de aproximadamente 20-40% cuando se contaron las células 100-200.

3. Parámetros técnicos de los Confocal Configuración del escáner de imágenes en directo

  1. ScanMode XYZT; Pinhole [aireado] 1,00; zoom 3,5; Resolución 8 bits; DPSS láser 561 nm, argón, láser visible 488 nm, láser de He / Ne visibles 633 nm; Objetivo HCX PL APO CS 63X 1,40 OIL UV; Apertura numérica 1.4; Velocidad de escaneo 700 Hz, el índice de refracción 1,52.
  2. 3-D Presentación de la imagen se prepararon Imaris software de imágenes 7.0.

4. Imagen confocal de mitosis en las células fijas

  1. Seed 2 x 10 5 células MDA-MB-231 células de cáncer de mama (ATCC), fibroblastos de embriones de ratón normales (MEF), o PARP1 deficiente MEF (PARP - / -, preparado por el Dr. Francoise Dantzer) en cubreobjetos de vidrio en la placa de 6 pocillos en 2 ml de medio completo. Los cubreobjetos se lavaron con etanol al 96%, seguido de lavado con agua DD estéril, se secó durante 2 horas, y se colocaron en cada pocillo de la placa de 6 pocillos.
  2. Añadir PJ-34 (10-30 M) al medio y se incuban las células durante el tiempo necesario (generalmente hasta 96 horas).
  3. Lavar los cubreobjetos de una vez con PBS (solución salina tamponada con fosfato), y fijar las células por medio de incubación en metanol enfriado con hielo: solución de acetona (01:01), 7 min, -20 ° C.
  4. Aspirar la solución de fijación y dejar que se sequen los cubreobjetos en la campana química (en esta etapa, los cubreobjetos se pueden mantener en -20 ° C durante varias semanas).
  5. Lavar los cubreobjetos de una vez con PBST (PBS suplementado con 0,1% de Tween-20) para permeabilizar las membranas de las células y bloquear las células con 10% de NDS (suero de burro normal) en PBST ("solución de bloqueo ') durante 1 hora a TA.
  6. Se incuban las células fijadas permeabilized con Antibodi primariaES durante 2 horas a temperatura ambiente (para husillos y centrosomas tinción). Los anticuerpos se diluyeron en la solución de bloqueo como siguen: anti-tubulina α (dilución 1:250) y anti-γ tubulina (1:200 dilución). Los anticuerpos primarios se aplican de la siguiente manera: aplicar 100 l (en una gota) de una mezcla de los anticuerpos en la solución de bloqueo para cada cubreobjetos en la cubierta de la placa de 6 pocillos (la cubierta está al revés). Coloque cuidadosamente el cubreobjetos sobre la gota anticuerpos, células sembradas frente a la caída. Incubar los cubreobjetos se enfrentan los anticuerpos durante 2 horas a temperatura ambiente.
  7. Coloque el cubreobjetos de nuevo en los pocillos y se lavan las células 3 veces con PBST. A continuación, utilice el mismo procedimiento descrito en 4.6 para el etiquetado de las células en los cubreobjetos con los anticuerpos secundarios fluorescentes. Se incuban las células sobre los cubreobjetos con los anticuerpos secundarios durante 1 hora, temperatura ambiente, en la oscuridad. Los anticuerpos se diluyeron en la solución de bloqueo de la siguiente manera: Alexa Fluor 488 (dilución 1:1000; verde) y Alexa Fluor 568 (dilución 1:1000;rojo).
  8. Montar los cubreobjetos utilizando prolongar antifade reactivo de oro con DAPI (tinción de los cromosomas) y se incuban durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad que se seque.
  9. Examine la cubierta se desliza por microscopía confocal.

5. Viabilidad celular mide por la producción de ATP

La producción de ATP se mide mediante un kit de ensayo de detección de ATP luminiscente.

  1. Seed las células en placas de 96 pocillos, aproximadamente 20.000 células en 800 l de medio en cada pocillo. Tres pocillos de blanco deben ser utilizados para la determinación de la luminiscencia de fondo del medio.
  2. Preparar series de diluciones estándar de ATP a partir de aproximadamente 10 micras a 100 micras y mantener en hielo.
  3. Añadir 50 l de detergente a cada pocillo y sacudir la placa durante 5 min en un agitador orbital, a 700 rpm.
  4. Reconstituir cada vial del "sustrato liofilizado 'con 5 ml de" tampón de sustrato "en el kit.
  5. Añadir 50 l de la solución de substrato reconstituida a los pocillos, y agitarla placa durante 5 min en un agitador orbital, a 700 rpm.
  6. Mantenga la placa en oscuridad durante 10 min.
  7. Mida luminiscencia de cada bien por el lector de microplacas ELISA.

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Resultados

PJ-34 es un soluble en agua estable fenantridina 1 (Figura 1). Nuestros resultados anteriores revelaron la muerte celular y extra-centrosomas de-agrupados en varios tipos de células de cáncer de múltiples centrosomales fijos que fueron tratados con PJ-34. En contraste, las células normales en proliferación no fueron perjudicados 2,3. Centrosomas se identificaron mediante doble marcaje con anticuerpos dirigidos contra centrine1 y γ-tubulina en las células extra-centrosomales fijos <...

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Discusión

Vivo imagen confocal proporciona una documentación en tiempo real del efecto citotóxico de PJ-34 en las células de múltiples centrosomales en vivo durante la mitosis (Figura 3 y la información complementaria). Esta fue la primera documentación vivo atribuir la citotoxicidad de PJ-34 en células de cáncer humano a centrosomas adicionales de-agrupación y la muerte celular, lo que sugiere la inducción de la muerte celular mitótica catástrofe por PJ-34 5-9. En contraste, se observó la agrupación b...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Las fuentes de financiación de la investigación: un fondo conjunto de la empresa de la Universidad de Tel Aviv, la transferencia de tecnología, RAMOT y el Centro Médico Sheba-(M. CA y SI.), ICRF - Fundación para la Investigación del Cáncer de Israel (M. CA.) Y la Fundación Israel ciencia ( SI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
REACTIVOS
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (Suero fetal bovino)Invitrogen (GIBCO)12657 
Solución Pen-Strep-AmphoBiological Industries, Israel03-033-1B 
L-glutaminaInvitrogen (GIBCO)25030-024 
0.25% Tripsin-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200 
Placas de Petri de 92 mmNunc,Thermo scientific150350 
Placas de cultivo con fondo de vidrio recubiertas de poli-D-lisina de 35 mmMatTek Corporation, EE. UUP35GC-0-14-C 
Kit de ensayo de detección de ATP luminiscenteAbcamab113849 
NDS (Suero de burro normal)Jackson ImmunoResearch017-000-121 
Anticuerpo anti-&alfa;-tubulinaSigmaT9026dilución 1:250 (IF)
Anticuerpo anti-γ-tubulinaSigmaT5192dilución 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgGInvitrogenA-11017dilución 1:1.000 (IF)
Alexa Fluor 568 Burro Anti-Conejo IgGInvitrogenA-10042dilución 1:1.000 (IF)
Reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPI (montaje)InvitrogenP36935 
JetPEI (reactivo de transfección liposomal)Polyplus101-10 
EQUIPMENT
Microscopio confocalLeica (Mannheim, Alemania)TCS SP5II 
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Referencias

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