Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.
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Artículo de método
Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos
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En este artículo
Resumen
Resumen
La microglía son los residentes células similares a los macrófagos del sistema nervioso central (SNC) y, como tal, tienen un papel de importancia crítica en procesos fisiológicos y patológicos tales como la maduración del SNC en desarrollo, la esclerosis múltiple y lesión de la médula espinal. La microglía se puede activar y reclutó a la acción por una lesión o estimulación neuronal, tales como daño axonal visto en la EM o trauma cerebral isquémica resultante de un accidente cerebrovascular. Estos miembros inmunocompetentes del SNC también se cree que tienen papeles en la plasticidad sináptica en condiciones no patológicas. Empleamos protocolos para la microglía cultivo de los tejidos neonatales y adultos que tienen como objetivo maximizar el número de células viables y reducir al mínimo las variables de confusión, tales como la presencia de otros tipos de células del sistema nervioso central y los restos de cultivo celular. Utilizamos componentes del SNC grandes y fácilmente perceptible (por ejemplo, la corteza, los segmentos de la médula espinal), lo que hace que todo el proceso sea factible y reproducible. El uso de célula adultas es una alternativa adecuada para el uso de la microglía del cerebro neonatal, como muchas patologías estudiadas afectan principalmente a la médula espinal después del parto. Estos sistemas de cultivo también son útiles para probar directamente el efecto de los compuestos que pueden inhibir o promover la activación de la microglia. Puesto que la activación microglial puede dar forma a los resultados de la enfermedad en el SNC adulto, hay una necesidad de sistemas in vitro en el que la microglía neonatal y adulto puede cultivar y estudió.
Introducción
La microglía son las células inmunes residentes del SNC, se asemejan más estrechamente macrófagos periféricos en la estructura y la función 1. Recientemente se ha demostrado que las células microgliales postnatal derivan de progenitores mieloides primitivas y se generan antes de que el octavo día de la embriogénesis, volteando la noción anterior de que los progenitores hematopoyéticos postnatales son la fuente de la microglia en el cerebro adulto 2. Juegan un papel clave en varias enfermedades neurológicas y pueden responder rápidamente a una infección o lesión mediante la liberación de citoquinas pro-inflamatorias o anti-inflamatoria 3.
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Protocolo
1. Disección (día 0)
- Inducir la anestesia que p0-2 crías de ratón con la hipotermia. Limpie las cabezas de los cachorros con un Kimwipe empapado en etanol al 70% para desinfectar el tejido.
- Retire las cabezas con un par de tijeras, con 4 crías por 10 cm placa de cultivo. Coloque las cabezas en una placa de Petri que contiene tampón de helado Hank.
- Anclar los cabezales con pinzas curvas a través de las cuencas de los ojos y retirar con cuidado la piel que cubre el cráneo con microforceps rectas.
- Retirar los huesos del cráneo con microforceps rectas, teniendo cuidado para no romper o dañar la corteza. La manera más efectiva es p....
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Resultados
Un ejemplo de las células microgliales en reposo y activados se muestra en la Figura 1. La microglía se visualizaron 24 h después de la siembra (Figura 1a) y exhiben morfología ramificada (en reposo). La exposición al reactivo de cebado, lipopolisacárido (LPS) bacterianos en los resultados de los cambios en la morfología microglial como las células se activan (Figura 1b).
Un ejemplo de recuento de las células para la deposición se mues.......
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Discusión
La microglía modular SNC funcionamiento normal, así como las respuestas inflamatorias a diversas patologías. Funcional remodelación sináptica por la microglía se ha implicado en el mantenimiento de la homeostasis normal del cerebro 15. Durante la cascada neurogénica que participan en el aclaramiento de las células progenitoras neurales de la circunvolución dentada del hipocampo 4, 16. Por lo tanto, es necesario desarrollar un sistema de cultivo en el que para estudiar la microglía neonatal y adulto.......
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Divulgaciones
Los autores tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio Tsirka por sus consejos y comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, un IGERT NSF-3MT y una disertación comunión Turner a LT, y NSF-3MT IGERT a JCN.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaína, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Piruvato de Sodio | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Sulfato de gentamicina | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm plato de cultivo de tejidos | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lisina, 100 μ g/ml | Diluido 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
Referencias
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M.
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Reimpresiones y permisos
