Artículo de método

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

DOI:

10.3791/50648

⸱

9 de octubre de 2013

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1Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania, 2Biomedical Graduate Studies, University of Pennsylvania, 3Department of Animal Biology and Center for Animal Transgenesis and Germ Cell Research, University of Pennsylvania, 4Department of Genetics, University of Pennsylvania, 5Department of Biology, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

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El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

Resumen

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La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos. Actualmente, no existe un sistema de cultivo celular fiable que permite la diferenciación espermatogénica in vitro, y la mayoría de los estudios biológicos de las células de espermatogénesis requiere la cosecha de tejidos de los modelos animales como el ratón y la rata. Debido a que el testículo contiene numerosos tipos de células - a la vez no espermatogénesis (de Leydig, de Sertoli, mieloides y células epiteliales) y de espermatogénesis (espermatogonias, espermatocitos, espermátidas redondas, condensación espermátidas y espermatozoides) - estudios de los mecanismos biológicos que intervienen en la espermatogénesis requerir el aislamiento y el enriquecimiento de estos diferentes tipos de células. El método STA-PUT permite la separación de una población heterogénea de células - en este caso, de los testículos - a través de un gradiente de BSA lineal. Tipos de células individuales sedimentan con diferente velocidad de sedimentación según la cetamaño LL, y fracciones enriquecidas para diferentes tipos de células pueden ser recogidos y utilizados en otros análisis. Mientras que el método STA-PUT no da lugar a fracciones altamente puras de tipos de células, por ejemplo, como se puede obtener con ciertos métodos de clasificación de células, proporciona un rendimiento mucho más alto del total de células en cada fracción
(~ 1 x 10 8 células / tipo de células espermatogénica de una población a partir de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimiento requiere sólo la cristalería especializada y se puede realizar en cualquier habitación fría o un refrigerador grande, por lo que es un método ideal para los laboratorios que tienen acceso limitado a los equipos especializados como un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) o elutriador.

Introducción

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La espermatogénesis en mamíferos es un complejo proceso de diferenciación que se produce en varias etapas en los túbulos seminíferos de los testículos 1. Brevemente, el vástago-como espermatogonias que residen cerca del epitelio de la brecha de los túbulos seminíferos y diferenciarse en espermatocitos, que luego se someten a divisiones meióticas. Después de la meiosis es completa, las células haploides resultantes, o espermátidas redondas, se someten a la espermiogénesis, un proceso de diferenciación que implica el derramamiento de citoplasma y compactación del núcleo. Espermátidas desarrollan gradualmente un flagelo y se someten a la elongación y la conde....

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Protocolo

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El protocolo de STA-PUT implica tres etapas: 1) Puesta en marcha de los aparatos y reactivos, 2) Preparación de la suspensión de células de testículos enteros, y 3) la carga de la célula, la sedimentación y la recogida de fracciones. Cuando es realizada por un equipo de dos investigadores, el protocolo de toma ocho horas en promedio.

1. Configuración del Aparato STA-PUT (Figura 1)

*** Aparato de STA-PUT debe ser colocado en un refrigerador grande 4 ° C o una habitación fría que también puede acomodar un colector de fracciones, si se prefiere que el método de colección.

  1. La noche antes (o al menos una....

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Resultados

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El resultado ideal el procedimiento STA-PUT es una separación bastante notable de las células de los testículos basado en el tamaño celular y la densidad. Mientras que las células aisladas de los testículos se sedimentan a través de la gradiente de BSA, varias bandas distintas de células pueden ser observados. Cualquier grupos de células tienden a hundirse hasta el fondo del gradiente y no contaminar las otras fracciones. Un poco más arriba el gradiente será el gran somáticas y células meióticas. Más arriba la pendiente.......

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Discusión

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Los que estudian la espermatogénesis se basan en modelos animales para muestras de células de espermatogénesis, como sistema fiable de cultivo celular todavía no existe para generar todos los tipos celulares de espermatogénesis 3. Aunque las células de espermatogénesis se recogen fácilmente de testículos enteros, sólo una población mixta resultante. Esto plantea un problema para aquellos que desean estudiar los subtipos específicos de estas células, como las células meióticas, espermátidas redondas y espermát.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este protocolo está demostrado implica el uso de ratones de laboratorio y fue ejecutado en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y organismos reguladores. Los animales utilizados en este protocolo se mantienen bajo la guía y la aprobación de la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Pennsylvania (protocolo de IACUC # 804284).

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por el NIH subvenciones GM055360 a SLB y U54HD068157 de RGM. JMB fue apoyado por la Subvención de Entrenamiento T32 Genética de la Universidad de Pennsylvania (GM008216).

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Materiales

Se puede utilizar de de equipos Tubos de Colector de fracciones

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BSAAffymetrix/USB10857 100MGAlternative.
Soluciones BSA al 0,5 %, 2 % y 4 %Disuelva 0,25 g, 11 g y 22 g (respectivamente) en volúmenes totales de 50 ml, 550 ml y 550 ml de 1x KREBS (respectivamente).A realizar el día del procedimiento STA-PUT. Filtro esterilizante.
KREBS (10x)3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrosa + 3,78 g CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, llevar a 2 L con autoclave/filtro ddH20y almacenar a 4 & grados; C durante varios meses.
KREBS (1x)Disolver 4,24 g de NaHCO3 en 100 ml ddH20. Añadir 200 ml 10x KREBS. Llevar a 2 L con ddH20.A realizar el día del procedimiento STA-PUT. Filtro esterilizante.
ColagenasaSigmaC9891-1G
DNAseSigmaDNEP-5MG
TripsinaSigmaT9201-1G
DAPIPreferencia del investigador
Triton-X100Preferencia del investigador
Formaldehído (~37%)Preferencia del investigador
TABLA 2: EQUIPO
Catálogola empresa#Comentarios
Aparato completo STA-PUT Tiendade vidrio ProScienceSTA-PUT (este procedimiento utiliza la cámara de sedimentación estándar: Cat. Nº 56700-500)Incluye toda la cristalería y el equipo para el aparato. Hay disponible cristalería alternativa para realizar STA-PUT con números de celda más pequeños.
10 μ Filtro de mallaFisherbrand 22363549
Herramientas de disección para ratonesPreferencia del investigador
recolección de fracciones de fondo redondo de 14 ml con tapasPreferencia del investigador
Necesita aproximadamente 100 tubos
GE Healthcare Life SciencesModelo: Frac-920, Código de producto: 18-1177-40Se puede utilizar una alternativa.
Portaobjetos de microscopio, cubreobjetosPreferencia del investigador
Microscopio de luz/fluorescentePreferencia del investigador

Referencias

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  1. Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
  2. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006)....

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Separaci n de c lulas espermatog nicasaislamiento de c lulas testicularessedimentaci n por gradiente de BSArecolecci n de fracciones celularesan lisis por microscop a de fluorescenciaan lisis por Western blotdiferenciaci n del tama o celularevaluaci n de la morfolog a nuclearenriquecimiento de c lulas germinales

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