Summary
L'articolo descrive un metodo per la produzione di una matrice acellulare di ratto intestino. La derivazione di ponteggi intestinale è importante per le future applicazioni in ingegneria dei tessuti, biologia delle cellule staminali e test anti-droga.
Abstract
Ingegneria tissutale riuscito coinvolge la combinazione di scaffold con cellule idonee in vitro o in vivo. Ponteggi possono essere sintetico, di derivazione naturale o derivati da tessuti / organi. Questi ultimi sono ottenuti utilizzando una tecnica chiamata decellularization. Decellularization può comportare una combinazione di metodi enzimatici fisici, chimici, e. L'obiettivo di questa tecnica è quello di rimuovere tutte le tracce cellulari mantenendo la macro e micro-architettura del tessuto originale.
Ingegneria tessuto intestinale ha finora utilizzato ponteggi relativamente semplici che non replicano la complessa architettura del fegato nativo. Il focus di questo lavoro è quello di descrivere una tecnica decellularization efficiente per ratto piccolo intestino. L'isolamento del piccolo intestino in modo da garantire il mantenimento di una connessione vascolare è descritto. La combinazione di soluzioni chimiche ed enzimatiche per rimuovere le cellule whilst preservare l'asse villo-cripta sotto l'aspetto luminale del patibolo è impostato anche fuori. Infine, la valutazione di scaffold prodotti per caratteristiche adeguate è discusso.
Introduction
L'ingegneria tissutale (TE) offre un'alternativa terapeutica del trapianto di organi, bypassando problemi di immunosoppressione e la carenza di organi. TE ha recentemente avuto applicazioni di successo nella clinica, con sostituzione di organi come la vescica 1, 2 uretra e trachea, sia negli adulti e nei bambini 3,4 5.
Costruzione di un organo tissutale richiede la combinazione di un ponteggio con le opportune cellule. Un ponteggio può essere preparato usando derivazione naturale (ad esempio collagene) e (ad esempio acido poli-L-glicolico; PLGA) materiali sintetici, o essere ottenuta con la decellularization di organi e tessuti nativi. Ponteggi che sono stati utilizzati finora per TE intestinale sono principalmente di due decellularized (piccola sottomucosa intestinale) o sintetica (acido poli-L-glicolico e acido poli-lattico) 6-13. Questi biomateriali sono molto semplici sia in macro e micro-architettura, chepuò non essere l'ideale se intestino tissutale deve essere clinicamente tradotto. Un biomateriale ottimale per l'intestino dovrebbe avere un albero vascolare innata che può essere collegato all'alimentazione sangue dell'ospite, una parete tubolare livelli con proprietà diverse per riflettere gli strati della parete intestinale e un asse villi cripta sul lato luminale per aiutare con ripopolamento da parte delle cellule staminali epiteliali.
Decellularization è una nuova metodologia che produce ponteggi rimuovendo le cellule di organi interi pur mantenendo la loro originale architettura 14. Questo è preferibile scaffold già esistente dal momento che replicano non solo la struttura dell'organo ma anche contengono indicazioni chimiche incorporati nella matrice extracellulare (ECM) che aiuti la proliferazione e la differenziazione cellulare. Nel 2008 un trachea cadavere è stato decellularized 14, seminati con cellule proprie del paziente, e trapiantato a sostituire le principali bronco sinistro in un giovane
Abbiamo anche adattato la stessa metodologia per produrre un piccolo intestino ponteggio decellularized 21. L'obiettivo del metodo qui descritto è di produrre matrici intestinali decellularized che mantengono le caratteristiche macroscopiche del tessuto originale, come la fornitura di sangue, così come l'architettura microscopica dell'asse villi-cripta nel lume intestinale. Crediamo che questo metodo potrebbe infine essere adottata per altri organi per migliorare l'efficienza di decellularization.
Protocol
1. Isolamento di Rat Intestino
- Preparare una soluzione 1 L di Soluzione tampone fosfato (Sigma, UK) con 1% antibiotico / antimicotico (Sigma, UK) (PBS / AA). Montare la pompa peristaltica (Masterflex L / S a velocità variabile) con due tubi. Eseguire il 70% di etanolo (EtOH) attraverso i tubi della pompa peristaltica per 15 min a velocità massima, seguito da PBS / AA per altri 15 min.
- Euthanize adulti Sprague-Dawley peso di circa 250-350 g di CO 2 per inalazione e dislocazione cervicale in conformità con le linee guida locali animali e omologazioni (nel Regno Unito, gli orientamenti Home Office sotto gli Animali (Scientific Procedures) Act 1986).
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima dell'uso. Spruzzare e pulire l'addome dell'animale con il 70% EtOH.
- Eseguire una incisione laparotomica xifo-pubica sull'addome per garantire un campo chirurgico chiaro.
- Sventrare tenue sul lato destro dell'animale su un tovagliolo di carta spruzzato con il 70% EtOH. Take cura di bagnare continuamente l'intestino con PBS / AA in modo da evitare la disidratazione del tessuto e denaturazione della matrice extracellulare (ECM).
- Individuare l'arteria mesenterica superiore (SMA) derivante da un angolo di 90 ° dall'aorta verso l'intestino. Utilizzare un G cannula 27 per immettere il SMA dall'aorta e rapidamente estrarre l'ago per evitare di strappare la parete del recipiente. Far avanzare il tubo di plastica della cannula nella SMA e fissarlo con suture (Vicryl 5/0).
- Confermare incannulamento iniettando 1 ml di PBS / AA. Utilizzare forbici a molla per incidere la aorta prossimale e distale alla SMA in modo da rilasciare la cannula.
- Per evitare la fuoriuscita di feci quando sezionare l'intestino crasso, posizionare un (seta 5/0) sutura nodo sull'estremità prossimale della giunzione ileo-cecale e uno all'estremità distale del sigma. Poi tagliare l'ileo terminale e del colon tra i due nodi e rimuovere l'intestino crasso.
- Tagliare l'intestino al digiuno-duodenale incrocio unnd liberare l'intestino da eventuali collegamenti del tessuto connettivo che potrebbe avere con l'addome.
- Trasferire il piccolo intestino in una capsula di Petri con PBS / AA. Incannulare la sezione prossimale dell'intestino con una pipetta Pasteur di plastica (LSL Laboratorio di consumo) e fissarlo in posizione con punti di sutura. Tagliare la pipetta in modo che si adatti il Luer-Lok di una siringa da 60 ml (BD Plastipak). Lavare il lume intestinale 2x con 60 ml di PBS / AA per rimuovere le feci e detriti.
2. Decellularization Metodologia
- Collegare la cannula vascolare a tre vie rubinetto. Ciò faciliterà la manipolazione, minimizzare la tensione sull'albero vascolare e consentire la rimozione di bolle dal tubo.
- Iniziare a correre acqua deionizzata (resistività 18,2 mW / cm) attraverso la pompa rullo a velocità variabile Masterflex L / S a 0,6 ml / h. Assicurarsi che nessun bolle sono presenti all'interno di tubi prima di collegare il lume intestinale rubinetto. Alcune bolle possono essere presenti all'interno del lume dal passaggio1.9, che può compromettere il processo di decellularization. Variare la velocità della pompa e gestire il tessuto con una pinza con attenzione per garantire l'uscita bolle dall'estremità distale. Non collegare la cannula vascolare fino a quando questo processo è finito in quanto velocità elevate potrebbero danneggiare l'albero vascolare.
- Trasferire apparato per la cella, in quanto la successiva fase di decellularization è eseguita a 4 ° C. La bassa temperatura consente la rimozione di cellule minimizzando decomposizione tessuto. Porre la capsula di Petri in un contenitore che raccoglierà la soluzione traboccante. Profumato sia lume intestinale e l'albero vascolare con acqua deionizzata (resistività 18,2 mW / cm) per 24 ore a 0,6 ml / h. Per controllare la prima ora l'apparecchio regolarmente per assicurare tutti i collegamenti siano sicuri, la perdita è minima e assenza di bolle sono presenti all'interno dell'intestino.
- Dopo 24 ore di trattamento con acqua deionizzata, spostare apparato decellularization esternamente alla cella come il resto dei passaggi sonoeffettuate a temperatura ambiente (RT).
- Pesare desossicolato di sodio (Sigma, UK) per preparare 300 ml di una soluzione al 4% in acqua deionizzata. Pesare sodio desossicolato sotto una cappa di aspirazione, in quanto è un irritante orale e oculare. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. La soluzione può essere conservata a 4 ° C per 1 mese.
- Cambiare la soluzione deionizzata al sodio desossicolato, controllare i collegamenti, rimuovere eventuali bolle e profumato a 0,6 ml / h per 4 ore.
- A seguito della fase di lavaggio sodio desossicolato con PBS / AA per 30 min per evitare interazioni tra il sodio desossicolato e DNasi-I.
- Pesare deossiribonucleasi-I (DNasi-I, Sigma) e preparare 250 ml di una soluzione di 2.000 kU in 1 M di cloruro di sodio, pH 7,4. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Questa soluzione deve essere preparata immediatamente prima dell'uso e non può essere conservato.
- Profumato con DNasi-I per 3 ore a temperatura ambiente ad una velocità di 0,6 ml / hr.
- Dopo la fase di DNasi-I, trasferire l'patibolo in una cappa di coltura tissutale e cambiare piatti e strumenti. Si consiglia di utilizzare una tecnica asettica.
- Lavare con PBS / AA per 30 minuti al fine di garantire tutti i resti delle soluzioni decellularizzazione vengono rimossi. Posizionare il patibolo in una nuova piastra di Petri e versare in un Crosslinker UV (Spectroline, Stati Uniti). Eseguire due cicli di sterilizzazione. Conservare in 5% PBS / AA e cambiare la soluzione ogni 3 giorni.
Representative Results
Su decellularization successo (Figura 1), il ponteggio deve avere un aspetto macroscopico simile a quello dell'intestino nativo, ma con pareti traslucide (Figura 2A). La conservazione di macro-architettura dovrebbe essere evidente dalla pervietà dell'albero vascolare. Quando colorante viene iniettato attraverso la cannula SMA, dovrebbe distribuire uniformemente tutta l'impalcatura e raggiungere l'albero capillare (Figura 2B). Il ponteggio deve essere privo di materiale nucleare e citoplasmatica, qualcosa che può essere valutata utilizzando un kit di quantificazione del DNA e semplice analisi istologica. Ematossilina e eosina (H & E) devono dimostrare l'assenza di materiale nucleare e citoplasmatica pur conservando i piccoli strati intestinali (Figura 3a). In particolare, il mantenimento dei villi e cripte sul lato luminale dovrebbe essere evidente seguente microscopia elettronica a scansione (Figura 4). Laconservazione dei componenti della matrice extracellulare come glicosaminoglicani collagene, elastina e dovrebbe anche essere previsto. Ad esempio, Trichrome display colorazione di Masson intatto il tessuto connettivo nel ponteggio (Figura 3B).
Figura 1. . Piano sperimentale Timeline di procedimento decellularization; PBS / AA: tampone fosfato con NaDeoxy antibiotico-antimicotico,: deoxycholate sodio, RT: temperatura ambiente, DNAse-I: deossiribonucleasi-I. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Scaffold macroscopicac caratteristiche. aspetto macroscopico del piccolo intestino di ratto in seguito decellularization successo (A). Iniezione di Rosso Ponceau tingere attraverso la SMA dimostra una rete vascolare intatto (B); SMA: mesenterica superiore Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. . Istologia H & E (A) e MT (B) colorazione indicano l'assenza di materiale cellulare con la conservazione dell'architettura tessuto connettivo; H & E: ematossilina e eosina, MT: tricromica di Masson. Barra della scala:. 100 micron Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . 
Figura 4. . Microscopia elettronica a scansione al microscopio elettronico indica il conservato l'architettura dei villi-crypt nel lume ponteggio; Scala bar:. 100 micron Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Discussion
Le fasi più difficili nella creazione di questo esperimento implicano l'incannulamento della SMA e la creazione e il mantenimento della sterilità. Cannulating la SMA nei roditori senza rompersi la parete può essere molto difficile a causa delle dimensioni e della posizione della nave. In alternativa, una sutura può essere posizionato intorno dell'aorta prossimale prima origine SMA, seguita da incannulazione dell'aorta sé distalmente, dirigendo la cannula di plastica nella SMA. Durante decellularization una combinazione di scarsa posizionamento cannula e portate elevate può portare a perdere l'accesso vascolare. La sterilità è una questione importante a causa della quantità di flora batterica presente nell'intestino tenue. Lavaggio con PBS / AA raccolto successivo è molto importante, e qualsiasi segno di materia fecale o detriti deve essere rimosso dal lume. Effettuazione di una porzione del ponteggio in un tubo Falcon con DMEM nell'incubatrice seguente sterilizzazione UV dovrebbe essere un indicatore se la sterilità è stato raggiunto. Nel casodi colonizzazione batterica, i media cambierà il pH con il suo colore girando da rosso a giallo. Per far fronte a ciò, ulteriori cicli UV sono invitati nonché lavaggio con PBS contenente un'alta concentrazione di antibiotico / antimicotico.
Una possibile modifica avere un ponteggio con accesso sia vascolare e venosa sarebbe incannulare la vena cava inferiore (IVC) nonché la SMA. Decellularization dai lati venose e vascolari deve essere eseguita in modo intermittente per tutte e tre le soluzioni. Decellularization continua può scoppiare i capillari facendo pressione positiva su entrambi i lati.
Nel corso degli anni ci sono stati una serie di sforzi intestinale TE utilizzano differenti combinazioni di cellule-scaffold in vitro e in vivo 6,9,12. La maggior parte del lavoro è stato eseguito utilizzando tubolari non tessuto 95% PGA-5% scaffold PLGA rivestiti con collagene di tipo I 6,7,13,22. A seguito di semina con intestinaleunità epiteliali organoide (UO) e un periodo dell'impianto nel omento di topi, formano cisti con il muscolo all'esterno e all'interno epitelio che possono poi essere tubularizzato. Tuttavia, la porosità e la semplicità nella progettazione di questi scaffold non consente per la generazione di grandi pezzi di intestino artificiale in un ambiente in vitro come quello di un bioreattore. Inoltre, la mancanza di una rete vascolare innata che può essere collegato al destinatario limita ulteriormente l'uso di questo scaffold per la traduzione clinica. Oltre agli esperimenti con i ponteggi PGA-PLGA, altri gruppi hanno utilizzato collagene o SIS ponteggi, entrambi i quali non replicano la complessità del tratto intestinale. SIS in particolare è l'unico precedente metodologia pubblicata dell'ingegneria tessuto intestinale ed è stato utilizzato in più di 150 regolazioni mediche, dimostrando la capacità di ponteggi decellularized per fornire stabilità meccanica e promuovere la crescita delle cellule mentre piombozione di nessuna risposta immunogenica. Tuttavia, la mancanza di adeguate macro-e micro-architettura, ha portato a scarsi risultati nel suo 'utilizzazione a fini intestinali TE 9-11,23.
I vantaggi della metodologia decellularization abbiamo descritto includono la conservazione delle caratteristiche microscopiche come il luminal architettura cripta-villo che rappresentano un ambiente appropriato per il ripopolamento dalla intestinale nicchia delle cellule staminali. Sotto l'aspetto macroscopico, la presenza di una rete vascolare gerarchica consentirà allegato al destinatario, consentendo fornitura di sostanze nutritive e ossigeno a tutto strato del TE-intestinale 21. Per di più, la manutenzione dei componenti ECM come glyocosaminoglycans collagene, elastina e ha un ruolo importante non solo per caratteristiche meccaniche, ma anche dirigere la proliferazione e la differenziazione cellulare. Soprattutto, la capacità della metodologia decellularization per essere scalata in grandetessuti r pur mantenendo le stesse caratteristiche è una caratteristica importante per la traduzione clinica di TE.
Lo sviluppo di una matrice intestinale naturale con una rete vascolare permette la creazione di grandi segmenti di intestino artificiale che può essere collegata al sistema host.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Wake Forest Institute di Medicina Rigenerativa per il loro aiuto con lo sviluppo di questo protocollo. Noi riconosciamo il sostegno da finanziamenti della carità Great Ormond Street Hospital, la Fondazione Eugenio Litta (Ginevra, Svizzera), il Medical Research Council, il Royal College of Surgeons of England, i bambini Sparks Medical Charity, il Foreign Office britannico per il Regno Unito / USA Stem Cell Collaboration Award e del Fondo di ricerca Mittal. Vorremmo anche ringraziare la Fondazione Royal Society / Wolfson per la concessione di ristrutturazione del laboratorio di ingegneria tissutale ottenuto per il Dipartimento di Chirurgia Pediatrica presso l'Istituto di Salute del Bambino. PDC e SE sono supportati da Carità Great Ormond Street Children del Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
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