Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Resumen

Creación de los desprendimientos de retina experimentales con una altura reproducible y sostenida de desprendimiento, y sin hemorragia subretinal, es importante para el estudio de la fisiopatología de la pérdida de células de fotorreceptores en la enfermedad de la retina y la evaluación de las intervenciones terapéuticas potenciales. Aquí, se presenta un procedimiento de este tipo en detalle.

Resumen

Subretiniana inyección de hialuronato de sodio es un método ampliamente aceptado de inducir el desprendimiento de retina (DR). Sin embargo, la altura y la duración de la RD o la aparición de hemorragia subretiniana pueden afectar a la muerte de las células fotorreceptoras en la retina desprendida. Por lo tanto, es ventajoso para crear los DR reproducibles sin hemorragia subretiniana para evaluar la muerte celular de fotorreceptores. Hemos modificado un método reportado previamente para crear bullosa y RDs persistentes en una zona reproducible con baja incidencia de hemorragia subretiniana. El paso crítico de este método modificado es la creación de una incisión escleral de auto-sellado, que puede evitar la fuga de hialuronato de sodio después de la inyección en el espacio subretiniano. Para hacer la incisión escleral de auto-sellado, se crea un túnel escleral, seguido por la penetración de la esclerótica en la coroides con una aguja de 30 G. Aunque se puede producir hemorragia coroidea durante este paso, astriction con una lanza quirúrgica reduce la tasa de dobladillo coroideaorrhage. Este método permite un modelo más reproducible y fiable de la muerte de los fotorreceptores en enfermedades que implican RD tales como regmatógeno RD, retinopatía del prematuro, retinopatía diabética, coriorretinopatía serosa central, y degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

Introducción

La muerte de las células fotorreceptoras y la posterior disminución visual se produce cuando los fotorreceptores se separan del epitelio pigmentario de la retina subyacente. La separación física de los fotorreceptores se observa en diversos trastornos de la retina, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), coriorretinopatía serosa central, retinopatía diabética, y retinopatía de la prematuridad, así como regmatógeno (es decir, causada por una rotura en la retina) desprendimiento de retina ( RD). Inyección subretiniana de hialuronato sódico es un modelo ampliamente aceptado para crear un RD que conduce a la muerte de células fotorreceptoras, proporcionando información sobre la fisiopatología de la degeneración de los fotorreceptores ^1-15.

Degeneración de los fotorreceptores inducida por la inyección subretiniana hialuronato de sodio, por primera vez en 2001 ^7, tiene la ventaja de un curso de tiempo razonable (días a semanas). Sin embargo, puede tener una variabilidad significativa de la pérdida de las células fotorreceptoras del animal al ánimal debe a dos factores principales que afectan a la muerte de las células fotorreceptoras después RD: 1) la altura y duración de la RD, y 2) la ocurrencia de hemorragia subretiniana. Hay una curva de aprendizaje empinada técnica al método que contribuye a ambos factores. Aumenta la degeneración de las células fotorreceptoras con la altura de la RD, como la distancia entre el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y fotorreceptores capa aumenta ^16-17. De acuerdo con estos informes, los experimentos anteriores mostraban más muerte de los fotorreceptores en los DR ampollosas que RDs poco profundas. También se ha informado de que la hemorragia subretinal es tóxico para las células fotorreceptoras y afecta a la muerte de las células fotorreceptoras ^18-21. Asimismo, hemos observado más muerte de los fotorreceptores en los DR con hemorragia subretiniana que RDs sin hemorragia subretiniana. Por lo tanto, las técnicas para minimizar la variabilidad tienen que centrarse en la consecución de alturas consistentes de RD evitando la hemorragia subretiniana.

Nuestro método modificado de enducir RD puede hacer bullosa reproducible y RD persistente en la misma posición del ojo con baja incidencia de hemorragia subretiniana. Se realizó la cirugía utilizando un enfoque temporal debido a que es más fácil de lograr un campo operativo más amplio en comparación con otros sitios. Después de la incisión conjuntival, una incisión escleral de auto-sellado se realiza utilizando una aguja de 30 G. Se crea un túnel escleral, seguido por la penetración de la esclerótica en la coroides. Si la hemorragia coroidea se produce en esta etapa, la hemorragia se sale del ojo a través de la herida escleral, y el sangrado puede ser detenido por astriction con una lanza quirúrgica. Una punción de la cámara anterior se lleva a cabo a continuación de la córnea para reducir la presión intraocular. Este es un paso importante, ya que la inyección subretiniana solo dará lugar a un aumento de la presión intraocular con la oclusión de la arteria retiniana resultante y la isquemia de la retina interna. Una aguja de calibre 33 conectada a una jeringa Hamilton l 10 se inserta entonces en el espacio subretiniano, y 3,5 μ; L hialuronato de sodio se inyecta suavemente para desprender la retina neurosensorial del EPR subyacente. En contraste con otros métodos de inducción de RD que se lleva a cabo bajo la observación del fondo de ojo, esta técnica se realiza bajo observación directa. Desde la herida escleral cuenta con un sello, el hialuronato de sodio no se saldrá después de la inyección. Por último, el pegamento se coloca en la herida escleral, y la conjuntiva se vuelve a unir a su posición original. Estos dura pasos también reducen el riesgo de fugas de hialuronato de sodio. La inyección de hialuronato de sodio 3.5 l crea RDs reproducibles (50% de la retina) en los ojos de ratones de 8 semanas de edad. La creación de la herida auto-sellado es el paso más importante en nuestro procedimiento modificado, ya que evita que el hialuronato de sodio inyectado se salga del ojo, permitiendo así bullosa reproducible y RDs persistentes.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología Declaración para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research, y las directrices y normas establecidas por el Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comité de Cuidado de Animales.

1. Pretratamiento

1. Se anestesia a 8 semanas de edad de ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de 60 mg / kg de ketamina y 6 mg / kg de xilazina.
2. Cortar los bigotes. Esto se hace debido a que interfieren con la visualización y la colocación del instrumento.
3. Dilata la pupila con un 5% fenilefrina y tropicamida al 0,5%.
4. Cortar los cilios. Esto también se hace debido a que interfieren con la visualización y la colocación del instrumento.
5. Aplicar anestesia tópica (0,5% de clorhidrato de proparacaína solución oftálmica).

2. Cirugía Bajo el microscopio

1. Ajuste el ratón en una pos lateralition con la nariz hacia el cirujano. Un pellizco del dedo del pie se realiza para confirmar la anestesia quirúrgica y guantes estériles se puso antes de comenzar la cirugía.
2. Una incisión en la conjuntiva temporal en el limbo posterior y separar la conjuntiva de la esclerótica. Evitar penetrar en la esclerótica. Después de este paso, tome la conjuntiva en el limbo con una pinza para controlar el ojo.
3. Hacer una incisión escleral de auto-sellado utilizando la punta de una aguja de 30 G con el bisel apuntando hacia arriba. Hacer un túnel escleral través de la esclerótica y penetrar en la esclerótica en la coroides (Figura 1). No penetrar la retina. Si la hemorragia coroidea se produce y sale a través de la herida escleral, realizar una astriction con una lanza quirúrgica hasta que el sangrado se detenga. Esta herida escleral será auto-sellado con presión intraocular.
4. Pinche la córnea con una aguja de 30 G para reducir la presión intraocular. Utilice la aguja paralela al iris para evitar lesiones en el iris y la lente durante enIntente en la cámara anterior. La presión intraocular se causar la herida a la auto-sellado.
5. Inserte una aguja de 33 conectado a una jeringa Hamilton de 10 l en el espacio subretiniano con el bisel apuntando hacia abajo (hacia el interior del ojo), e inyectar hialuronato de sodio 3.5 l suavemente para desprender la retina neurosensorial del EPR subyacente. Evite que penetra en la retina con la aguja de 33 G, porque hialuronato de sodio voy a entrar en el espacio vítreo, pero no el espacio subretiniano si la retina se penetra. También, evitar la inyección rápida porque creará un desgarro oral y hialuronato de sodio se escape en la cámara anterior.
6. Deje que el humor acuoso fluya fuera de la punción de la córnea empujando la córnea alrededor de la perforación corneal con fórceps para ajustar la presión intraocular.
7. Confirmar la ausencia de fugas de la herida escleral utilizando una lanza quirúrgica.
8. Para reducir el riesgo de fugas de hialuronato de sodio, colocar pegamento quirúrgico de cianoacrilato enla herida escleral.
9. Vuelva a colocar la conjuntiva a su posición original utilizando pegamento quirúrgico cianoacrilato. Esto reducirá aún más el riesgo de fugas de hialuronato de sodio.
10. Compruebe el fondo de ojo mediante una cubierta de vidrio y confirme la creación de un RD ampollar sin hemorragia subretiniana.

3. Después del tratamiento

1. Aplicar ungüento antibiótico bacitracina al ojo para reducir el riesgo de infección.
2. Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica para evitar la anestesia (mezcla de ketamina y xilazina) cause baja temperatura corporal después de la presión arterial baja.
3. Ponga los ratones de nuevo a la jaula de los animales después de que se despiertan de la anestesia. Monitorear los ratones diarios para las complicaciones. Si surgen complicaciones, la eutanasia a los ratones como se describe a continuación.

4. Sacrificio

1. La eutanasia a los ratones por dislocación cervical después de la inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de pentobarbital de sodio, y enucleate El ojos en los puntos de tiempo apropiados para cada experimento (no se muestra). Evite aplicar presión en el ojo durante la enucleación debido hialuronato de sodio puede salirse. DR ampollosas deben ser persistentes durante al menos 14 días.

Resultados

Para evaluar la persistencia de la RD realizadas por este protocolo, cryosections se realizaron los días 3, 7 y 14 después de la inducción de la RD. Seis ojos se utilizaron para cada punto de tiempo. Hematoxilina y eosina (HE) tinción se utiliza para visualizar las secciones. Todas las secciones mostraron un RD bulloso acercarse a la lente (Figura 2). Un ojo mostró hemorragia subretiniana en el día 7. No hay ojos mostraban algún signo de infección o lesión de la lente.

Figura 1. Creación de una incisión escleral de auto-sellado. Este esquema muestra una imagen en sección transversal de un ojo normal de ratón. La línea roja indica la incisión escleral de cierre automático. Un túnel escleral seguido por la penetración de la esclerótica en la coroides con una aguja de 30 G crea una incisión escleral de auto-sellado. Esta herida escleralserá auto-sellado con la presión intraocular, que puede evitar la fuga de hialuronato de sodio después de la inyección en el espacio subretiniano y lograr desprendimientos de retina ampollosas persistentes.

Figura 2. Evolución temporal de desprendimiento de retina. Esta foto del fondo de ojo muestra un desprendimiento de retina bulloso sin hemorragia subretiniana inmediatamente después de la cirugía. Criosecciones con hematoxilina y eosina (HE) tinción espectáculo persistente desprendimiento de retina bulloso sin hemorragia subretiniana través de por lo menos 14 días.

Discusión

Existen varios métodos para el establecimiento de un modelo de desarrollo rural en los ojos de roedor se han reportado ^{3-15, 22.} La mayoría de ellos utilizan la inyección subretiniana de hialuronato de sodio debido a que es un material viscoso utilizado comúnmente durante la cirugía intraocular en seres humanos, y no se asocia con ninguna toxicidad ocular conocido ^1-15. El hialuronato de sodio, en lugar de solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato (PBS), aumenta la duración de la RD.

Los métodos para la inyección subretiniana de hialuronato sódico usan uno de dos enfoques: un enfoque transvítrea ^3-6 o un enfoque transescleral ^7-15. Ambos métodos se llevan a cabo con la observación del fondo de ojo. En el enfoque transvítrea, un inyector de subretiniano se introduce en la cavidad vítrea, un retinotomía se crea en la retina periférica, y el hialuronato de sodio se inyecta en el espacio subretiniano. En este método, se hacen dos lágrimas de la retina, lo que aumenta el riesgo de la retinal hemorragia que podría ir en el espacio subretiniano. Además, hay un riesgo de lesión de la lente cuando se crea el retinotomía. Hay varios métodos modificados para el enfoque transescleral. En la mayoría de estos métodos ^7-12, después de reducir la presión intraocular con un pinchazo de la cámara anterior, una aguja de 30 G conectada a una jeringa llena de hialuronato de sodio se inserta directamente en el espacio subretiniano través de la conjuntiva, la esclerótica, la coroides, y el RPE. El hialuronato de sodio se inyecta a continuación en el espacio subretiniano. El riesgo de desgarro de la retina y el cristalino lesión utilizando este método transescleral es menor que usando el enfoque transvítrea. Sin embargo, el agujero hecho en la esclerótica por una aguja de 30 G es grande, especialmente para los ojos del ratón, y el hialuronato de sodio se inyecta en el espacio subretiniano se escapa fácilmente fuera del ojo a través de la herida escleral. Esto conduce a una, RD menos persistente inferior y la muerte de las células fotorreceptoras más variable. Por otra parte, si la hemorragia coroidea se produce enla etapa de perforación de la esclerótica, la hemorragia se extienda en el espacio subretiniano porque la presión intraocular se ha reducido antes de la inyección de hialuronato subretiniano.

Varios factores pueden influir en el efecto de RD en el desprendimiento de retina, incluyendo tanto la hemorragia subretinal y la altura y la persistencia de RD ^16-21. Células fotorreceptoras muerte aumenta con el aumento de altura de RD ^{16, 17,} y el daño de las células fotorreceptoras pueden ser más extensa debido a la menor difusión de oxígeno y nutrientes esenciales de los coriocapilar con mayor RD en comparación con RD poco profunda. Hemorragia subretiniana también es tóxico para las células fotorreceptoras ^18-21; posibles mecanismos de esta toxicidad en el desprendimiento de retina incluyen la hipoxia y la alteración metabólica por la hemorragia subretiniana como barrera de difusión, y la neurotoxicidad directa inducida por los componentes de la sangre (como el hierro). Lesión de la lente, que ha sido divulgado para tener un efecto protector sobre Retilas células ganglionares nal ^23, también pueden afectar a la muerte de las células fotorreceptoras después de la inducción de la RD. Además, si el sitio de entrada de la herida no está sellado, hialuronato de sodio puede salirse con la manipulación ojo durante la enucleación. Esto puede conducir a una clasificación errónea de un RD tan superficial, que a su vez puede afectar a la interpretación de los resultados.

Hemos modificado el método transescleral para inyección subretiniana de hialuronato de sodio para aumentar la reproducibilidad de RDS y reducir la tasa de hemorragia subretiniana. El paso crítico de este protocolo es la creación de una incisión escleral de auto-sellado utilizando una aguja de 30 G, que evita la fuga de hialuronato de sodio después de la inyección. A diferencia de los métodos anteriores, este protocolo se realiza sin la observación del fondo de ojo por lo que se presta mayor atención a la herida escleral. Aplicación de pegamento también evita que el hialuronato de sodio se salga del ojo. En nuestra experiencia, la tasa de hemorragia subretiniana con este protocolo wcomo significativamente menor que con otros protocolos. Si la hemorragia coroidea se produce durante la etapa de incisión escleral, saldrá del ojo a través de la herida escleral porque este paso se lleva a cabo antes de reducir la presión intraocular. Si la hemorragia coroidea se produce después de la reducción de la presión intraocular y desprendimiento de la retina neurosensorial, la sangre se diseccionar en el espacio subretiniano. Encontramos que esto suceda en aproximadamente el 5% de los casos, en contraste con un 10-20% con las otras técnicas. Estos animales deben ser excluidos del análisis.

Esta técnica también se puede utilizar para la inyección subretiniana de la transferencia de genes mediada por vectores para dirigir las células fotorreceptoras o RPE ^{24, 25.} Debido a que el típico vehículo (PBS, solución salina) para estas inyecciones es significativamente menos viscoso que el hialuronato de sodio, técnicas estándar están plagados de más fugas. La técnica descrita en el presente documento, mediante la reducción de este riesgo, hace experimentos de transferencia de vector más reproducible yconfiable.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketaject	Phoenix	2010025
AnaSed	LLOYD	4004821
5% Fenilefrina / 0.5% Tropicamide	Massachusetts Eye and Ear Pharmacy
0.5% Proparacaína Clorhidrato Solución Oftálmica AKORN		17478-263-12
Provics	Alcon
Webglue	Patterson Veterinary	07-8566128
Microscopio	Leica	MG90
30G1/2 PrecisiónGlide Aguja	BD	305106
Weck-Cel Eye Spears	Beaver-Visitec	0008685
10 Jeringa de Microlitros	Hamilton	7635-01
Calibre 33, aguja de 0,5 pulgadas	Hamilton	7803-05
Cubierta de vidrio 18x18mm	Fisher Scientific	18-548A