Tiempo de cursos para la actividad glicosilasa de 8-oxoguanina ADN glicosilasa son bifásicos exhibiendo una explosión de la formación de producto y una fase de estado estacionario lineal. La utilización de técnicas de flujo de enfriamiento rápido, la ráfaga y las tasas de estado estable se pueden medir, que corresponden a la escisión de 8-oxoguanina y la liberación de la glicosilasa a partir del ADN del producto, respectivamente.
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Artículo de método
Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad
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Resumen
Resumen
Humano 8-oxoguanina ADN glicosilasa (OGG1) escinde el mutagénico oxidativo lesión del ADN 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxo G) a partir de ADN. La caracterización cinética de OGG1 se llevó a cabo para medir las tasas de escisión 8-oxo G y la versión del producto. Cuando la concentración es más baja que OGG1 sustrato de ADN, la evolución temporal de la formación de producto son bifásicos; una fase exponencial rápida (es decir ráfaga) de formación de producto es seguida por una fase de estado estacionario lineal. El estallido inicial de la formación de producto corresponde a la concentración de enzima debidamente enganchado sobre el sustrato, y la amplitud de la ráfaga depende de la concentración de enzima. La constante de la ráfaga de velocidad de primer orden corresponde a la frecuencia intrínseca de la escisión 8-oxo G y la tasa de estado estacionario más lenta mide la tasa de liberación del producto (producto de ADN de disociación constante de velocidad, k fuera). A continuación, se describen los enfoques de estado estacionario, pre-estado de equilibrio, y de un solo volumen para aislar y medir sppasos ecific durante OGG1 ciclo catalítico. Un oligonucleótido marcado con fluorescente lesión que contiene y OGG1 purificados se utilizan para facilitar mediciones cinéticas exactas. Dado que las concentraciones bajas de enzimas se utilizan para realizar mediciones en estado estacionario, la mezcla manual de los reactivos y el temple de la reacción se puede realizar para determinar la tasa de estado estacionario (k fuera). Además, la extrapolación de la tasa de estado estacionario a un punto en el eje de ordenadas en el tiempo cero indica que un estallido de formación de producto se produjo durante el primer volumen de negocios (es decir, intersección y es positivo). La constante de la fase de estallido exponencial de velocidad de primer orden se puede medir usando una técnica de mezcla y enfriamiento rápido que examina la cantidad de producto formado a intervalos de tiempo cortos (<1 seg) antes de la fase de estado estacionario y corresponde a la tasa de 8 -oxo G escisión (es decir, química). El paso química también se puede medir usando un enfoque de un solo volumen de negocios donde el ciclismo es catalíticaimpedido por el ADN sustrato saturando con la enzima (E> S). Estos enfoques pueden medir constantes de velocidad elementales que influyen en la eficacia de la eliminación de una lesión del ADN.
Introducción
Un ambiente aeróbico acelera la inestabilidad genómica. Una importante lesión del ADN promutagenic resultante de estrés oxidativo es 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxo G). Esto es debido al potencial de codificación ambigua de 8-oxo G. Human 8-oxoguanine DNA glicosilasa (OGG1) es responsable de iniciar la base de reparación por escisión de 8-oxo G. La actividad glicosilasa de OGG1 extirpa la base 8-oxo G resulta en ADN producto con un sitio apurinic (AP-site). Una actividad liasa débil OGG1 puede incidir la AP-site en algunos casos.
La caracterización cinética de ADN glycosylases general encuentra que exhiben cursos de tiempo bifásicos. Desp....
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Protocolo
1. Preparación de la enzima y el sustrato de ADN
- Over-express OGG1 como una proteína de fusión GST en E. coli, utilizan la etiqueta de GST para la purificación, y luego retire la etiqueta de GST por escisión con HRV-3C proteasa (Figura 1) 6.
- Compre la síntesis química 5'-6-carboxifluoresceína (6-FAM) oligonucleótido marcado que contiene un único residuo de 8-oxo G y su cadena de oligonucleótido no marcado complementaria. Los oligonucleótidos 34-mer contienen una 8-oxo G en la posición 17 desde el extremo 5 '. Purificar estos oligonucleótidos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
- P....
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Resultados
Análisis de la cinética de estado estable se realizó mediante el uso de 200 nM sustrato de ADN y cuatro diferentes concentraciones aparentes de OGG1 (15, 30, 45, y 60 nM) como se determinó por un ensayo de proteínas Bradford 2. Los cursos de tiempo de formación de producto se ajustaron a una ecuación lineal para determinar la ordenada en el origen, que fueron 2,2, 11, 15, y 26 nM, respectivamente, en relación a cada concentración de proteína (Figura 2B). Las intersecciones se representaron má.......
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Discusión
Los enfoques cinéticos descritos aquí perfilar métodos para definir las constantes cinéticas primarias. Si un curso de tiempo de formación de producto es bifásica, con la primera rotación enzimática ocurre rápidamente, a continuación, un paso después de la química es limitante de la velocidad durante pérdidas de balón catalíticos subsiguientes. En el caso de OGG1, la primera rotación se puede medir utilizando altas concentraciones de enzimas, ya sea con la limitación (S E) las concentraciones de ADN.......
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Divulgaciones
Los autores tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Damos las gracias a la Dra. Julie K. Horton para la lectura crítica del manuscrito y el Dr. Rajendra Prasad por sus útiles sugerencias y discusiones. Parte de esta investigación fueron publicados originalmente en The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "Efectos de la secuencia de ADN del contexto de la actividad glicosilasa de ADN humano glucosilasa 8 oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Esta obra fue financiada en su totalidad o en parte, por los Institutos Nacionales de Investigación en Salud Proyecto de Donación Z01-ES050158 en el Programa de Investigación Intramural, NIEHS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5'-6-FAM que contienen un solo oligonucleótido radiomarcado 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5'-P32. Se recomienda el grado de purificación en gel de poliacrilamida. | |
| Oligonucleótidos no marcados (hebra complementaria) | recomienda el grado de purificación en gel de poliacrilamida | Eurofins MWG Operon | |
| Jeringa desechable BD Luer Lock de 1 ml | BD Medical | 309628 | se puede utilizar la jeringa desechable Lue Lock de otros proveedores. |
| Jeringa desechable BD Luer Lock de 10 ml | se puede utilizar la jeringa desechable BE Medical 309604 Luer Lock de otros proveedores. | ||
| Equipment | |||
| circulante | Cualquier vendedor | ||
| de Instrumento de Flujo de Enfriamiento Rápido RQF-3 | KinTek Corporation | de otros proveedores también puede ser utilizado. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager de otros proveedores también se puede utilizar. | |
| KaleidaGraph | Synergy |
Referencias
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H.
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Reimpresiones y permisos
