Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Summary

Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados ​​en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.

Abstract

En la presente memoria, se describe un protocolo para medir simultáneamente seis proteínas en la saliva utilizando una matriz de anticuerpos basados ​​en microesferas de fibra óptica. La tecnología de inmuno-matriz empleada combina las ventajas de la suspensión de microesferas a base de matriz de la fabricación con el uso de microscopía de fluorescencia. Como se describe en el protocolo de vídeo, comercialmente disponibles microesferas de polímero 4,5 micras fueron codificados en siete tipos diferentes, que se diferencian por la concentración de dos colorantes fluorescentes atrapados físicamente dentro de las microesferas. Las microesferas codificadas que contienen grupos carboxilo superficiales fueron modificados con anticuerpos de captura monoclonales través de la química de acoplamiento EDC / NHS. Para ensamblar el microarray de proteínas, los diferentes tipos de microesferas codificadas y funcionalizados se mezclaron y se depositan aleatoriamente en 4,5 micras micropocillos, que fueron grabadas químicamente en el extremo proximal de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica se utiliza como un portador y para obtener imágenes de la microspheres. Una vez montado, se utilizó el microarray para capturar las proteínas en el sobrenadante de la saliva obtenida de la clínica. La detección se basa en un inmunoensayo de tipo sándwich usando una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados para diferentes analitos con una sonda fluorescente conjugada con estreptavidina, R-ficoeritrina. La micromatriz Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia en tres canales diferentes, dos para el registro de microesferas y uno para la señal de ensayo. Las micrografías de fluorescencia se descodifican y se analizaron usando un algoritmo de hecho en casa en MATLAB.

Introduction

Desde la primera micromatriz reportado por Mark Schena y compañeros de trabajo a mediados de la década de 1990, esta potente herramienta se ha utilizado en muchos campos de la investigación biológica ^1. Microarrays de anticuerpos capaces de detectar simultáneamente múltiples proteínas en los fluidos de diagnóstico, tales como la sangre, tienen aplicaciones importantes en el diagnóstico clínico y la detección de biomarcadores ^2-10. La saliva, que contiene muchos de los mismos analitos como la sangre, ha sido considerada como una alternativa preferible a la sangre debido a la toma de saliva es segura, no invasiva, y puede ser llevado a cabo por el personal médico mínimamente entrenados ^11-13. Actualmente, el análisis de proteínas multiplexada usando muestras de saliva está limitado por varios factores importantes, incluyendo la baja concentración de analito diana ¹⁴ y el amplio intervalo de concentración de diferentes biomarcadores ^15.

.

En este documento, se demuestra el análisis de seis proteínas: factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), proteína inducida por gamma-interferón 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento epidérmico (EGF), metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9), y la interleucina-1 beta (IL-1β) . El rendimiento del método se verificó inicialmente usando soluciones estándar que constituyen las proteínas recombinantes de analito y tampón de bloqueo. Muestras de saliva real obtenida de pacientes de diferentes enfermedades respiratorias crónicas, así como también controles sanos se probaron con un rendimiento satisfactorio. El protocolo debe ser aplicable a otros analitos de proteínas y otros ensayos basados ​​en microesferas. Esta plataforma ofrece ventajas considerables para el campo de la Química Analítica, ya que permite el análisis simultáneo rápido, preciso, y reproducible de bajas concentraciones de varias proteínas con un amplio rango dinámico, un mínimo de interacciones no específicas, la reducción del consumo de la muestra, y de bajo costo en comparación con un Ensayo inmunoenzimático análoga (ELISA).

Protocol

Figura 1. . Flujo de trabajo para la aplicación de matriz de anticuerpos de microesferas de fibra óptica a la saliva de perfiles (1) Las microesferas se codifican internamente con dos colorantes fluorescentes; (2) las microesferas codificadas son modificados externamente con anticuerpos monoclonales específicos de proteínas; (3) las microesferas multiplexadas se mezclan, y (4) depositadas al azar en micropocillos grabadas en el extremo proximal de un haz de fibra óptica; (5) proteínas salivales son capturados por las microesferas a través de inmunoensayo de tipo sándwich, y (6) cuantificaron utilizando microscopía de fluorescencia.

1. Las microesferas de codificación

1. Pesar europio sodio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) en un vial de vidrio ámbar y preparar una solución de 200 mM en tetrahidrofurano (THF). Mezclar suavemente con la pipeta; verificar visualmenteel colorante se disuelve completamente.
2. Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) en un vial de vidrio ámbar y preparar una solución madre 12 mM en THF. Mezclar suavemente con la pipeta, verifique visualmente que el colorante se haya disuelto completamente.
3. Preparar 700 l de solución de trabajo para cada tipo de microesfera usando las soluciones madre y THF para alcanzar la concentración final de la lista en la Tabla 1.
4. Asegúrese de microesferas (10% w / v) son bien suspendidas mediante agitación con vórtex, y luego transferir 60 l de suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Añadir 600 l de PBS a la suspensión de microesferas y mezclar pipeteando 20x. Centrifugar el tubo a 10.000 rpm durante 3 min y retirar con cuidado el sobrenadante. Repita este proceso otra 2x para lavar las microesferas.
6. Lavar el sedimento de microesferas 3x con THF usando un procedimiento similar que en el paso 1.5.
7. Se centrifuga la suspensión de microesferas / THF a 10.000 rpm durante 3 min, separar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 600 lSolución de trabajo de la lista en la Tabla 1. Transferir la mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
8. Selle el tubo de microcentrífuga con Parafilm y colocarlo en un agitador. Agitar a 3.000 rpm y se incuba durante 24 horas, protegerlo de la luz cubriendo la configuración mediante el uso de una caja cubierta con papel de aluminio.
9. Centrifugar la suspensión de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar un pellet.
10. Retire la solución de colorante líquido sobrenadante, lavar las microesferas 6X con 600 l de metanol y luego con 600 l de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 6x otra, tal como se describe en el paso 1.5.
11. Guarde las microesferas codificadas en 600 l de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 a 4 ° C hasta su uso, proteger de la luz.

Nombre del tipo de microesferas:	1	2	3	4	5	6	7
Eu-TTA (mM)	100	100	10	100	10
C30 (mM)		1	1	6	6	1	6

Tabla 1. Las concentraciones de Eu-TTA y C30 soluciones de trabajo.

2. Preparación de Microesferas de Proteína de captura

1. Preparar tampón MES [2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS al 0,01%, pH 5,7] y tampón PBS / SDS (fosfato de sodio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS al 0,01%, pH 7.4) con antelación a temperatura ambiente.
2. Añadir 200 l codificado suspensión de microesferas (que contiene ~ 2 mg de microesferas) en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga Safe-Lock. Es importante la utilización de este tipo de tubo de microcentrífuga para evitar derrames durante la incubación en el paso 2.6.
3. Lavarse las microesferas con 600 mu l tampón MES 3x como se describe en el paso 1.5. Añadir 700 mu l MES al sedimento de microesferas y se mezcla bien con la pipeta.
4. Preparar 0.105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, PM = 191,7 g / mol) y 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluciones en tampón MES en tubos separados.
5. Añadir 150 l recién preparada EDC solución gota a gota a la suspensión de microesferas. La EDC hidroliza muy rápidamente, por lo que es imprescindible el uso de una solución recién hecha para asegurar la eficacia de la inmovilización. Inmediatamente después de la adición del EDC, añadir 150 l solución de sulfo-NHS para las microesferas, mezclar bien pipeteando y verifique la suspensión es homogénea.
6. Tapar el tubo, sellarlo con Parafilm, y colocarlo en un agitador. Agitar a 1.500 rpm durante 4 horas, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio.
7. Centrifugar las suspens microesferasde iones a 10.000 rpm durante 3 min para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar las microesferas con 500 l de PBS / SDS 3x tampón como se ha descrito en el paso 1.5.
8. Añadir 200 l de tampón PBS / SDS al sedimento, mezclar bien las microesferas y pasar la solución a 300 l de tampón PBS / SDS que contiene 60 microgramos anticuerpos de captura. Es importante a suspender el sedimento de microesferas primero y luego añadir la suspensión de microesferas en la solución de anticuerpo.
9. Incubar la mezcla de anticuerpos-microesferas por agitación a 1500 rpm durante 4 horas en un agitador, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio.
10. Centrifugar la suspensión de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar las microesferas con 500 l StartingBlock (TBS) el bloqueo de 3x tampón, como se describe en el paso 1.5.
11. Mezclar microesferas con 1 ml de TBS de tampón de bloqueo y se incuba microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora en un agitador, protegerlo de la luz utilizando una cala cuadrorojo con papel de aluminio.
12. Centrifugar la suspensión de microesferas a 7.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar el pellet 3x con 500 l de TBS tampón de bloqueo, como se describe en el paso 1.5.
13. Centrifugar la solución de microesferas a 7.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Añadir 500 l tampón de bloqueo TBS y mezclar con la pipeta.
14. Guarde la suspensión de microesferas modificado a 4 ° C hasta su uso, proteger de la luz.
15. Repita este procedimiento para hacer otros tipos de microesferas utilizando anticuerpos correspondientes.

3. Asamblea de fibra óptica Microarray

1. Mezclar 50 l de cada tipo de microesferas de proteína de captura en un nuevo tubo de microcentrífuga esterilizado en autoclave. Centrifugar las microesferas de valores en común a 7.000 rpm durante 3 min, y eliminar el sobrenadante de forma que el volumen restante es de aproximadamente 100 l.
2. Cortadas a mano manojos de fibra óptica a aproximadamente 5 cm de longitud ysecuencialmente pulir ambos extremos en una máquina de pulido utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, y 0,05 m de diamante de tamaño lapeado películas. Sonicar el haz de pulido en agua desionizada durante 2 minutos para eliminar cualquier partícula.
3. Ponga una pequeña barra de agitación magnética en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, añadir 400 l de PBS libre de proteínas de amortiguación y revolver en una placa de agitación magnética durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire.
4. Etch un extremo del haz de fibras pulido en una solución de HCl 0,025 N para 150 seg ^10,16. Inmediatamente sumergirse y someter a ultrasonidos el final grabado al agua fuerte en agua desionizada durante 1 min. Secar los haces de fibras con aire comprimido.
5. Monte el haz de fibras en un soporte de fibra y el bloque final grabado en el tampón PBS libre de proteínas libre de burbujas durante 1 hora.
6. Depósito 1 l alícuota de la suspensión de microesferas almacenada en el extremo grabado al agua fuerte del haz de fibra óptica. Proteger la configuración de la luz con una caja con papel de aluminio, y esperar 15 min. El volumen de la suspensión sedisminuir por evaporación y obligar a las microesferas en los pocillos grabados. Repita este paso de carga una vez más.
7. Use un hisopo saturado con solución de muestra para eliminar las microesferas que no están atrapadas en los micropocillos. El microarray de proteínas ya está listo para usar. Vaya inmediatamente al paso 4.1 para el análisis de la saliva.

4. Análisis de la muestra de saliva, con microesferas de Microarray

1. Añadir 200 l de solución de muestra (100 sobrenadante de saliva l diluyó con igual volumen de StartingBlock T20 (PBS) tampón de bloqueo. El protocolo de recogida de sobrenadante de la saliva ha sido publicado previamente ^10). en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en autoclave. Sumerja el microarray proteína cargada en la fibra en la solución y se incuba en un agitador a 600 rpm durante 2 horas, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio.
2. Preparar 20 ml de tampón de lavado mediante la adición de 200 l solución de BSA al 10% y 200 l 10% de Tween-20 en 19,6 ml de PBS, MIx bien agitando suavemente.
3. Sumerja los microarrays de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave que contiene 200 l de tampón de lavado y se agita a 600 rpm durante 2 min. Repita este 3x lavado.
4. Incubar la micromatriz en una solución de 100 l de un cóctel de anticuerpo de detección que contiene 5 g / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, anticuerpos de detección biotinilados de IL-1β en StartingBlock T20 (PBS) tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador a 600 rpm, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio.
5. Lave el microarray 3x con tampón de lavado como se describe en el paso 4.3.
6. Incubar los microarrays en 200 l de 20 mg / ml de estreptavidina conjugada R-ficoeritrina (SAPE) solución en PBS a 600 rpm en el agitador durante 10 min, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio.
7. Lave el microarray 5x con tampón de lavado como se describe en el paso 4.3.
8. Limpiar el extremo distal de la fibra (es decir, el extremo alejadoa partir de las microesferas) paquete con un hisopo saturado con etanol absoluto.
9. Secar ambos extremos de la fibra con aire comprimido. Montar la fibra en un microscopio de epifluorescencia y la imagen a través del extremo distal de la fibra.
10. Adquirir imágenes de microesferas que corresponden a Eu-TTA, C30 y SAPE intensidades de emisión de fluorescencia. Filtros ópticos configuración y los tiempos de exposición de imágenes de fluorescencia de Eu-TTA, C30 y SAPE se muestran en la Tabla 2.

Canal	Eu-TTA	C30	SAPE
Exciter	365/10x	350/50x	546/10x
Beamsplitter	525DCLP	400DCLP	560LP
Emisor	620/60m	460/50m	580/30m
Tiempo de exposición	1 seg	0.3 seg	1 seg

Tabla 2. Parámetros para las tres imágenes fluorescentes de la micromatriz.

Results

Las imágenes de fluorescencia de tres canales que muestran una pequeña sección del haz de fibra óptica se muestran en las Figuras 2A-C. Estas imágenes se analizaron utilizando un algoritmo escrito en MATLAB (como se describe en más detalle en la sección Discusión). El análisis utiliza tanto la información de la imagen de codificación de Eu-TTA (Figura 2A) y la imagen de codificación de C30 (Figura 2B) para decodificar las microesferas, y se calcularon las intensidades d...

Discussion

Los investigadores deben prestar especial atención a los siguientes pasos: para una mayor precisión de decodificación, es necesario verificar que las microesferas fueron suspendidas de forma homogénea en toda la incubación y el lavado pasos durante el proceso de codificación de microesferas. Además, las microesferas codificadas necesitan ser protegidos de la luz a lo largo de todo el experimento. Siguiendo los procedimientos de codificación y de almacenamiento adecuadas, encontramos que la precisión global de decodifica...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colorante Eu-TTA	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
Frasco de vidrio ámbar	Fisher Scientific	03-339-23B
Colorante cumarina 30	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Microesferas	Bangslabs	PC05N/6698
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x concentrado	Sigma-Aldrich	P5493-1L
Agua	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES solución salina tamponada	Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
Solución de NaOH	Fisher Scientific	SS256-500
Tubo de microcentrífuga con cierre seguro	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
Captura de VEGF humano anticuerpo	R& D Systems	MAB293
Humano IP-10 captura anticuerpo	R& D Systems	MAB266
Humano IL-8 captura anticuerpo	R& D Systems	MAB208
Captura de EGF humano anticuerpo	R& D Systems	MAB636
Captura de anticuerpos MMP-9 humanos	R& D Systems	MAB936
IL-1 humana y beta; captura de anticuerpos	R& D Systems	MAB601
Ratón IgG1 anticuerpo de control de isotipo	R& D Systems	MAB002
Tampón StartingBlock (TBS)	Thermo Scientific	37542
HCl solución estándar 1,0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0,5 ml tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-120
Tampón sin proteínas (PBS)	Thermo Scientific	37572
VEGF humano recombinante 165	R& D Systems	293-VE
Recombinante humano IP-10	R& D Systems	266-IP
IL-8 humano recombinante	R& D Systems	208-IL
EGF humano recombinante	R& D Systems	236-EG
MMP-9 humano recombinante	R& D Systems	911-MP
IL-1 humana recombinante y beta;	R& D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) tampón	Thermo Scientific	37539
Bloqueador BSA en PBS	Thermo Scientific	37525
Anticuerpo de detección de VEGF biotinilado	R& D Systems	BAF293
Biotinilado Anticuerpo de detección IP-10	R& D Systems	BAF266
Anticuerpo de detección de IL-8 biotinilado	R& D Systems	BAF208
Anticuerpo de detección de EGF biotinilado	R& D Systems	BAF236
Biotinilado MMP-9 anticuerpo de detección	R& D Systems	BAF911
IL-1 biotinilada y beta; anticuerpo de detección	R& D Systems	BAF201
Estreptavidina, R-ficoeritrina	Invitrogen	S-21388
Etanol (200 pruebas)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML