Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Shuai Nie; Elena Benito-Peña; Huaibin Zhang; Yue Wu; David R. Walt

doi:10.3791/50726

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Artículo de método

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

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DOI:

10.3791/50726

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10 de octubre de 2013

Shuai Nie¹ , Elena Benito-Peña¹^,² , Huaibin Zhang¹ , Yue Wu³ , David R. Walt¹

¹Department of Chemistry, Tufts University, ²Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), ³Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

En este artículo

Resumen

Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.

Resumen

En la presente memoria, se describe un protocolo para medir simultáneamente seis proteínas en la saliva utilizando una matriz de anticuerpos basados en microesferas de fibra óptica. La tecnología de inmuno-matriz empleada combina las ventajas de la suspensión de microesferas a base de matriz de la fabricación con el uso de microscopía de fluorescencia. Como se describe en el protocolo de vídeo, comercialmente disponibles microesferas de polímero 4,5 micras fueron codificados en siete tipos diferentes, que se diferencian por la concentración de dos colorantes fluorescentes atrapados físicamente dentro de las microesferas. Las microesferas codificadas que contienen grupos carboxilo superficiales fueron modificados con anticuerpos de captura monoclonales través de la química de acoplamiento EDC / NHS. Para ensamblar el microarray de proteínas, los diferentes tipos de microesferas codificadas y funcionalizados se mezclaron y se depositan aleatoriamente en 4,5 micras micropocillos, que fueron grabadas químicamente en el extremo proximal de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica se utiliza como un portador y para obtener imágenes de la microspheres. Una vez montado, se utilizó el microarray para capturar las proteínas en el sobrenadante de la saliva obtenida de la clínica. La detección se basa en un inmunoensayo de tipo sándwich usando una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados para diferentes analitos con una sonda fluorescente conjugada con estreptavidina, R-ficoeritrina. La micromatriz Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia en tres canales diferentes, dos para el registro de microesferas y uno para la señal de ensayo. Las micrografías de fluorescencia se descodifican y se analizaron usando un algoritmo de hecho en casa en MATLAB.

Introducción

Desde la primera micromatriz reportado por Mark Schena y compañeros de trabajo a mediados de la década de 1990, esta potente herramienta se ha utilizado en muchos campos de la investigación biológica ^1. Microarrays de anticuerpos capaces de detectar simultáneamente múltiples proteínas en los fluidos de diagnóstico, tales como la sangre, tienen aplicaciones importantes en el diagnóstico clínico y la detección de biomarcadores ^2-10. La saliva, que contiene muchos de los mismos analitos como la sangre, ha sido considerada como una alternativa preferible a la sangre debido a la toma de saliva es segura, no invasiva, y puede ser llevado a cabo por el....