Murino Cervical Trasplante Cardiaco Modelo Usando una técnica de Cuff Modificado

Resumen

El modelo de trasplante de corazón murino de cuello uterino es muy adecuado para inmunológica así como estudios de la lesión de reperfusión de isquemia. Hemos modificado el procedimiento utilizando una técnica de manguito no sutura y realizado más de 1.000 trasplantes de éxito con este enfoque.

En esto, proporcionamos detalles adicionales de esta técnica para complementar el vídeo.

Resumen

Los modelos de ratón son de especial interés en la investigación desde una amplia variedad de anticuerpos monoclonales y comercialmente definen endogámica y las cepas knockout están disponibles para llevar a cabo mecanicista en estudios in vivo. Mientras que los modelos de trasplante de corazón utilizando una técnica de sutura se desarrolló por primera vez con éxito en ratas, la traducción a un equivalente murino utilizado igualmente generalizada nunca se logró debido a la complejidad técnica del procedimiento de microcirugía. En contraste, las técnicas del manguito no sutura, también desarrolladas inicialmente en ratas, se adaptaron con éxito para su uso en ratones ^{de 1-3.} Esta técnica de revascularización implica dos pasos principales I) eversión del buque receptor sobre un manguito de polietileno; II) tirando del buque cedente sobre el buque receptor antes evertido y manteniéndolo en su lugar con un empate circunferencial. Esto asegura una continuidad de la capa endotelial, tiempo de funcionamiento corto y muy altas tasas de permeabilidad ^4. t "> Utilización de esta técnica para la anastomosis vascular que lleva a cabo más de 1.000 trasplantes de corazón cervicales con una tasa de éxito del 95%. Para arterial flujo de la arteria carótida común y el arco aórtico proximal se anastomosa dando como resultado una perfusión retrógrada del corazón trasplantado. Para el drenaje venoso de la arteria pulmonar del injerto se anastomosa con la vena yugular externa del receptor ^5.

En esto, proporcionamos detalles adicionales de esta técnica para complementar el vídeo.

Introducción

El trasplante cardíaco representa el tratamiento de elección para los pacientes que sufren de diferentes enfermedades cardíaca terminal. Los avances en las técnicas quirúrgicas, la profilaxis más eficaz de las infecciones y nuevas pautas de inmunosupresión como resultado notablemente mejorada resultado del trasplante de órganos ^6. Sin embargo, la supervivencia del injerto a largo plazo no ha mejorado rigurosamente en los últimos años ^7. El rechazo crónico, que se caracteriza por la arteriosclerosis de trasplante sigue siendo un obstáculo importante para la supervivencia del injerto a largo plazo ^8-11.

El modelo de trasplante heterotópico de corazón en ratones proporciona una herramienta importante y válido para el análisis de mecanismo inmunológico durante aguda, así como el rechazo crónico ^12-15.

Hasta la fecha el modelo de trasplante más frecuente sigue siendo el abdominal trasplante de corazón de ratón utilizando la técnica de sutura. La aorta ascendente del corazón del donante se anastomosa a la unabdominal aorta y la arteria pulmonar se anastomosa a la vena cava inferior del receptor. Gran parte de la dificultad microquirúrgica del modelo de sutura se basa en el pequeño tamaño de los vasos, que se suturan ^16,17.

En contraste con el modelo de sutura el corazón se coloca en la región del cuello del recipiente donde la vena yugular externa se anastomosa a la arteria pulmonar y la arteria carótida común la aorta del donante.

La razón de ser del desarrollo del modelo de trasplante de corazón cervical utilizando la técnica del manguito era tener un modelo animal, que permite lograr altas tasas de éxito con las habilidades básicas de microcirugía que permitirán una amplia aplicación de este modelo. Las principales ventajas de este método son la anastomosis se producen significativamente menos complicaciones tales como hemorragias y trombosis relacionada en comparación con el modelo de sutura ^18.

Protocolo

Los animales se alojan en un centro sin barreras patógeno. Todos los animales reciben atención humana en el cumplimiento de los "Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio" formuladas por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica "y la" Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ", elaborado por la Academia Nacional de Ciencias y publicados por la National Institutos de Salud (NIH Publication no. 86-23, revisado 1985). Todos los experimentos son aprobados por el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Austria.

1. destinatario Preparación

1. Anestesiar al animal receptor con una inyección im de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal).
2. Quite todo el pelo de la región cervical lateral del animal y fregar el campo operatorio tres veces usando chlorhexdine.
3. Coloque el ratón en una posición supina en el campo operatorio.
4. Siguiente hacer una incisión en la piel del inc yugularisión de la mandíbula inferior derecha.
5. Posteriormente, sin rodeos movilizar la vena yugular externa derecha (VYE) y dividir las ramas entre ligaduras.
6. Luego divida la VYE entre ligaduras asegurándose de dejar suficiente longitud para eversión del muñón proximal sobre el cuerpo del manguito.
7. A continuación, retire el lóbulo derecho de la glándula submandibular.
8. Para la anastomosis venosa pasar el extremo proximal de la VYE a través del manguito de polietileno y fijarlo en el mango del manguito con una abrazadera micro.
9. Retire la ligadura en el extremo de la embarcación, eversión de la luz sobre el manguito y fijarla con un 8-0 lazo de seda (Figura 1a).
10. Posteriormente seccionar el músculo esternocleidomastoideo derecha con cauterio bipolar para obtener acceso a la arteria carótida común.
11. Siguiente movilizar la arteria carótida común y cortar el vaso entre las ligaduras.
12. Siguiente movilizar la arteria carótida común y cortar el vaso entre las ligaduras.
13. Pase los disTal extremo del recipiente a través del manguito y fijarlo con la abrazadera arteria.
14. Retire la ligadura en el extremo del recipiente y distender el lumen usando dilatadores vasculares. A continuación, en analogía con el VYE, eversión de la arteria en el manguito y fijarla con un lazo de seda 8-0.

Contratación 2. Corazón

1. Anestesiar el ratón donante con una inyección im de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). A continuación, retire todo el pelo de la región abdominal del animal. Frote el operativo de campo tres veces usando chlorhexdine. Siguiente lugar el ratón en una posición supina en el campo quirúrgico como se describió previamente.
2. Después de una incisión abdominal en la línea media, retraiga las vísceras con Q-tips a la izquierda con el fin de exponer la vena cava inferior (VCI).
3. Inyectar 400 l de una mezcla 1: 4 heparina solución de sodio en el IVC para la heparinización.
4. Lleve a cabo una toracotomía y doblar la pared anterior del tórax sobre craneal para ganar access al corazón.
5. A continuación, retire el timo y hacer venteo incisiones en la vena cava superior izquierda y la derecha.
6. Posteriormente, perfundir el corazón de una manera retrógrada con solución de 4 ° Celsius HTK por canulación del arco aórtico con una G jeringa 27 en el nivel de la rama braquiocefálico.
7. Ligar la vena cava inferior y superior con 8-0 seda y dividirlos distal a las ligaduras.
8. Siguiente dividir el arco aórtico en el nivel de la canulación anterior y diseccionar libre del tronco pulmonar y se divide distalmente en la medida de lo posible.
9. Después de eso, atar las venas pulmonares con una ligadura en bloque y dividirlos distal a las ligaduras.
10. Por último, quite el corazón de la zona donante y almacenarlo en 4 ° centígrados solución HTK (Figura 1b).

3. Implantación

1. Coloque el injerto de corazón en la región del cuello destinatario en una posición al revés (Figura 1c ).
2. Siguiente tirar del tronco pulmonar del corazón sobre la construcción del manguito vena del receptor y fijarlo con un lazo de seda (Figura 1d).
3. Realizar la anastomosis entre la aorta del injerto y la arteria evertido del animal receptor de la misma manera (Figura 1e).
4. Posteriormente, retire la pinza venosa primero, seguido por la pinza arterial. El corazón está reperfunde y comienza a latir dentro de 1-2 min. Durante la reperfusión humedecer el corazón con agua tibia (35 ° Celsius) solución salina.
5. Por último cerrar la herida quirúrgica con 6-0 suturas continuas (Figura 1e).

4. Cuidado posoperatorio, punto final

1. Dé hasta 0,3 ml ip salina normal después de la operación para la reposición de líquidos.
2. Colocar el animal bajo una lámpara de calor hasta que despierta de la anestesia.
3. Una vez despierto, devolver el animal a la instalación de la vivienda donde reciben alimentos y agua ad libitum.
4. Para midolor de quitar importancia durante los primeros 7 días del postoperatorio administrar carprofeno (4 mg / kg por vía subcutánea cada 12 horas (sc). Además, dará buprenorfina (0,1 mg / kg) después de la operación cada 12 horas durante 5 días.
5. Obtener el peso (g) de cada destinatario de los animales semanalmente para evaluar la ingesta nutricional apropiada. Si hay evidencia de pérdida de peso más de un 10-15% en comparación con el peso en la cirugía fecha, la apatía, la paralizante o una espalda muy doblada, sacrificar al animal mediante la inhalación de isoflurano terminal antes de llegar al punto final clínico. También sacrificar al animal después de que el corazón ha sido rechazada.

Resultados

La Figura 2 muestra los datos de supervivencia de los aloinjertos cardiacos representativos de donantes BALB / c después del trasplante en MHC totalmente coincidentes C57BL / 6 destinatarios. Los corazones son rechazados en el día 7 ± 1 después del trasplante. Palpación del dedo del aloinjerto trasplantado es un método sensible para detectar el curso dependiente del tiempo del rechazo de aloinjertos. Todos los trasplantes de corazón singeneicos realizadas en nuestra serie sobrevivieron indefinidamente (...

Discusión

El rechazo de aloinjertos vascularizados implica una gran cantidad de diferentes medidas que sólo pueden evaluarse suficientemente utilizando modelos in vitro. Fenómenos como la sensibilización de los receptores, el procesamiento de antígenos en los órganos linfoides secundarios, sino también la diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes son mejor caracterizados in vivo. Los modelos animales son de esta manera la herramienta ideal para la investigación traslacional ^16. Los m...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Yasargil Clip Mini Permanente 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro clip para buque	S & T	B1 00396 V
Microtijera	FST	14075-11
Dilatador	recipientes S & T	D-5a.2 00125
Micropinzas	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Pinza para microbuque	S & T	B1 00396 V