El virus respiratorio sincitial humano (HRSV) puede causar bronquiolitis grave en lactantes pequeños. Parte de la patogenia de la enfermedad grave por HRSV es causada por la respuesta inmunitaria del huésped. La estimulación de las células inmunitarias humanas primarias con HRSV proporciona un sistema modelo rápido y reproducible para estudiar la activación de las vías inflamatorias y la infección.
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Artículo de método
Un modelo in vitro para estudiar las respuestas inmunitarias de las células mononucleares de sangre periférica humana a la infección por el virus respiratorio sincitial humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Las infecciones por el virus respiratorio sincitial humano (HRSV) presentan un amplio espectro de gravedad de la enfermedad, que va desde infecciones leves hasta bronquiolitis potencialmente mortal. Una parte importante de la patogénesis de la enfermedad grave es una respuesta inmunitaria mejorada que conduce a la inmunopatología.
Aquí, describimos un protocolo utilizado para investigar la respuesta inmunitaria de las células inmunitarias humanas a una infección por HRSV. En primer lugar, describimos los métodos utilizados para el cultivo, la purificación y la cuantificación del HRSV. Posteriormente, describimos un modelo humano in vitro en el que se estimulan células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) con HRSV vivo. Este sistema modelo se puede utilizar para estudiar múltiples parámetros que pueden contribuir a la gravedad de la enfermedad, incluida la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Estas respuestas se pueden medir a nivel transcripcional y traslacional. Además, la infección viral de las células se puede medir fácilmente mediante citometría de flujo. En conjunto, la estimulación de PBMC con HRSV vivo proporciona un sistema modelo rápido y reproducible para examinar los mecanismos implicados en la enfermedad inducida por HRSV.
Introducción
El Virus Respiratorio Sincitial Humano (HRSV) es la causa más común de infecciones del tracto respiratorio inferior en niños. Cada año, más de 33 millones de niños menores de cinco años se infectan con el virus del virus de la influenza humana, lo que provoca más de tres millones de hospitalizaciones y casi 200.000muertes. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que el HRSV también representa una amenaza significativa para los ancianos y adultos con enfermedades crónicas subyacentes2.
La mayoría de las infecciones por HRSV en niños pequeños se presentan con síntomas leves, comparables a los del resfriado común, y no r....
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Protocolo
Nota:
Los experimentos con HRSV deben realizarse en una cabina de seguridad biológica dentro de un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2. Recolecte todos los desechos virales y materiales que hayan estado en contacto con el virus para su eliminación adecuada debido a los riesgos biológicos.
Se deben tomar precauciones especiales al utilizar sangre humana que potencialmente esté infectada.
Es fundamental utilizar reactivos libres de endotoxinas en todos los protocolos.
1. Cultivo del HRSV A2
- Cultivar células HeLa o HEp-2 en medio DMEM + 10 % ....
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Resultados
El método de cultivo y purificación de HRSV A2 descrito aquí proporcionará un rendimiento entre 2 x 107 y 2 x 108 partículas virales infecciosas cuantificadas por FITC-50/ml. Los resultados del análisis microscópico, en el que se contaron células infectadas teñidas con FITC (resultados no mostrados), se compararon con los resultados de la cuantificación mediante FACS (Figura 1). Ambos métodos arrojaron títulos similares, aunque el método de FACS presentó una desviación estándar much.......
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Discusión
En este estudio, demostramos que la infección de PBMC con HRSV es un sistema modelo rápido y confiable en el que se pueden estudiar las vías inflamatorias. Para estimular las PBMC, se debe preparar y cuantificar una acción de HRSV.
Múltiples líneas celulares son susceptibles a la infección por HRSV. Las líneas celulares más utilizadas para el cultivo de HRSV son las células HEp-2, HeLa y Vero. Sin embargo, no recomendaríamos el uso de células Vero para el cultivo del HRSV porque se ha demostra.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
RSV A2 fue amablemente proporcionado por el Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Países Bajos). MV y GF cuentan con el apoyo del consorcio Virgo, financiado por el proyecto número FES0908 del gobierno holandés, y por el proyecto número 050-060-452 de la Iniciativa Genómica de los Países Bajos (NGI). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo | |||
| PBS | Lonza | BE17-516F | PBS sin Ca2+ Mg2+ o rojo fenol |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | HBSS, Calcio, Magnesio, sin Fenol Rojo |
| DMEM | Invitrogen | 31966-047 | DMEM, Alto Glucosa, GlutaMAX, Piruvato |
| RPMI | Invitrogen | 72400054 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES |
| Reduced Serum Medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 51985-026 | Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX |
| FCS | Greiner Bio-one | FBS (Fetal Bovine Serum) | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030 | Albúmina de suero bovino |
| P/S | Invitrogen | 15140-122 | Penicilina-Estreptomicina, |
| tripsina | Invitrogen | 25300-054 | 0.05% Tripsina-EDTA (1x), Fenol Rojo |
| Células HeLa | Células ATCC | CCL-2 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Sacarosa | Sigma Aldrich | S7903 | Sacarosa BioXtra, ≥ 99,5% |
| IgG2 anti-ratón-FITC | BD Pharmingen | 555057 | Ms IgG2b K Control de isotipos FITC |
| Anti-NP-RSV-FITC | Abcam | ab25849 | Anticuerpo anti-virus respiratorio sincitial [671] (FITC) |
| Medio de gradiente de densidad (Lymphoprep) | Tubos de | 1114545 | |
| EDTA | Axis-Shield BD Biosciences | 367525 | |
| Acetona | Merck Millipore | 1000141000 | Acetona para análisis |
| Material | |||
| Tubos centrífugos | Beckman Coulter | 326823 | Pared fina, Polialómero, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm |
| Rotor SureSpin 630 con cubos de 36 ml | Sorvall | 79368 | Cuchara oscilante rotor de titanio |
| Sorvall WX80 Ultracentrífuga Sorvall | 46900 | ||
| CB 150l CO2 | Aglutinante |
Referencias
- Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
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Reimpresiones y permisos
