Artículo de método

Un modelo in vitro para estudiar las respuestas inmunitarias de las células mononucleares de sangre periférica humana a la infección por el virus respiratorio sincitial humano

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DOI:

10.3791/50766

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10 de diciembre de 2013

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1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

En este artículo

Resumen

El virus respiratorio sincitial humano (HRSV) puede causar bronquiolitis grave en lactantes pequeños. Parte de la patogenia de la enfermedad grave por HRSV es causada por la respuesta inmunitaria del huésped. La estimulación de las células inmunitarias humanas primarias con HRSV proporciona un sistema modelo rápido y reproducible para estudiar la activación de las vías inflamatorias y la infección.

Resumen

Las infecciones por el virus respiratorio sincitial humano (HRSV) presentan un amplio espectro de gravedad de la enfermedad, que va desde infecciones leves hasta bronquiolitis potencialmente mortal. Una parte importante de la patogénesis de la enfermedad grave es una respuesta inmunitaria mejorada que conduce a la inmunopatología.

Aquí, describimos un protocolo utilizado para investigar la respuesta inmunitaria de las células inmunitarias humanas a una infección por HRSV. En primer lugar, describimos los métodos utilizados para el cultivo, la purificación y la cuantificación del HRSV. Posteriormente, describimos un modelo humano in vitro en el que se estimulan células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) con HRSV vivo. Este sistema modelo se puede utilizar para estudiar múltiples parámetros que pueden contribuir a la gravedad de la enfermedad, incluida la respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Estas respuestas se pueden medir a nivel transcripcional y traslacional. Además, la infección viral de las células se puede medir fácilmente mediante citometría de flujo. En conjunto, la estimulación de PBMC con HRSV vivo proporciona un sistema modelo rápido y reproducible para examinar los mecanismos implicados en la enfermedad inducida por HRSV.

Introducción

El Virus Respiratorio Sincitial Humano (HRSV) es la causa más común de infecciones del tracto respiratorio inferior en niños. Cada año, más de 33 millones de niños menores de cinco años se infectan con el virus del virus de la influenza humana, lo que provoca más de tres millones de hospitalizaciones y casi 200.000muertes. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que el HRSV también representa una amenaza significativa para los ancianos y adultos con enfermedades crónicas subyacentes2.

La mayoría de las infecciones por HRSV en niños pequeños se presentan con síntomas leves, comparables a los del resfriado común, y no requieren intervención clínica. Sin embargo, una pequeña proporción de pacientes requieren hospitalización y ventilación mecánica debido a una bronquiolitis grave.

Parte de la patogenia de la enfermedad por HRSV es la respuesta inmune excesivamente exuberante e inadecuada del huésped a la infección3,4. Esto se ilustra con varias observaciones. El período de máxima enfermedad suele estar precedido por el pico de infección viral y coincide mejor con la infiltración celular de los tejidos infectados y la liberación de citocinas inflamatorias3. Otra línea de evidencia proviene de los ensayos de HRSV INACTIVADO CON FORMALINA (FI-RSV) en la década de 1960. En lugar de inducir protección en los lactantes pequeños, la vacuna dio lugar a una respuesta inmunitaria exagerada que dio lugar a una mayor enfermedad respiratoria y a una mayor morbilidad y mortalidad.

Se han desarrollado varios modelos para estudiar la patogénesis de las infecciones por HRSV. Las líneas celulares continuas, como HEp-2 y A549, se han utilizado ampliamente para estudiar la infección por HRSV in vitro. Las células epiteliales son los principales objetivos de la infección por HRSV5, por lo que se ha prestado mucha atención a estos tipos de células. Sin embargo, la situación in vivo es mucho más compleja y no se limita a un tipo de célula. Con el fin de examinar estas complejas interacciones, se han desarrollado varios modelos de infección animal para estudiar la patogénesis del HRSV. Hasta ahora, se han empleado dos estrategias diferentes, centrándose en modelos heterólogos (no humanos) y en modelos de neumovirus del huésped afines. Ejemplos de modelos heterólogos para el HRSV incluyen chimpancés, ovejas, ratas de algodón y ratones. La infección por VRS en su huésped natural se ha estudiado en bovinos y ratones, utilizando VRS bovino y neumovirus, respectivamente.

Si bien cada uno de estos modelos ha proporcionado información importante sobre la patogénesis de la enfermedad, el HRSV está altamente adaptado a los humanos. Por lo tanto, como complemento a las líneas celulares y modelos animales utilizados actualmente, proponemos utilizar PBMCs primarias humanas como modelo para la estimulación con HRSV. Las PBMC humanas se pueden obtener de una variedad de individuos para abordar preguntas de investigación específicas, incluidos niños pequeños6, personas inmunodeprimidas, así como adultos sanos7 o personas ancianas8. Las PBMC se pueden utilizar para estudiar los aspectos innatos de la infección, así como la respuesta adaptativa al virus. Las vías inflamatorias activadas importantes para la patogénesis de la enfermedad por HRSV pueden estudiarse a nivel de ARNm y proteínas. Además, la infección viral de (subconjuntos de) células inmunitarias se puede determinar mediante citometría de flujo. Hemos utilizado este modelo previamente para identificar los efectos sinérgicos de la infección por HRSV junto con el ligando bacteriano dipéptido de muramilo (MDP) en la inducción de citocinas proinflamatorias7. Proponemos utilizar la estimulación del HRSV de las PBMC primarias humanas como un modelo in vitro robusto, fácil y rápido para estudiar las vías inflamatorias implicadas en la patogénesis de la enfermedad por HRSV.

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Protocolo

Nota:

Los experimentos con HRSV deben realizarse en una cabina de seguridad biológica dentro de un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2. Recolecte todos los desechos virales y materiales que hayan estado en contacto con el virus para su eliminación adecuada debido a los riesgos biológicos.

Se deben tomar precauciones especiales al utilizar sangre humana que potencialmente esté infectada.

Es fundamental utilizar reactivos libres de endotoxinas en todos los protocolos.

1. Cultivo del HRSV A2

  1. Cultivar células HeLa o HEp-2 en medio DMEM + 10 % de suero de ternero fetal (STF) + 1 % de penicilina/estreptomicina (P/E) en un matraz de 175 cm²2 matraz de cultivo hasta que alcancen aproximadamente un 50 % de confluencia.
  2. Lavar las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente (PBS).
  3. Descongele un vial con el virus de la cepa inicial de HRSV a 37 °C en un baño de agua. Diluya el stock de virus de modo que la MOI sea 0,1 o inferior. Esto evitará la generación de partículas defectivas interferentes (DIPs). Diluya el stock de virus en 4 ml/frasco de medio de infección (DMEM + 1 % P/S) y añádalo a las células HeLa o HEp-2. Mantenga este volumen lo más bajo posible sin que las células se sequen. Cuanto menor sea el volumen, mayor será la tasa de infección.
  4. Incubar 2-4 h a 37 °C, 5% CO₂2Agite suavemente el matraz cada 15 minutos para redistribuir el medio.
  5. Retire el inóculo y lave una vez con PBS.
  6. Añada 15 ml de medio de cultivo (DMEM + 10% FCS + 1% P/S) e incube durante 3-5 días a 37 °C, 5% CO₂2. Observe las células mediante microscopía de campo claro normal para detectar cambios citopatológicos inducidos por el virus, por ejemplo formación de sincitios y muerte y células en suspensión
  7. Cuando aparezca citopatología, recolecte el HRSV raspando las células y reúna la suspensión viral en un tubo estéril de 50 ml. Vortexee la suspensión celular. El raspado y el vortexeo de las células liberan más partículas virales.
  8. Centrifugar la suspensión viral durante 10 min a temperatura ambiente a 1.800 x g para sedimentar los restos celulares. El HRSV en el sobrenadante no se sedimenta a esta velocidad y el sobrenadante puede utilizarse directamente para infectar múltiples matraces de 175 cm2 matraces o puede almacenarse a -80 °C como stock de siembra en alícuotas de 1 ml para uso futuro. Siempre congele rápidamente el HRSV en nitrógeno líquido para evitar la pérdida de partículas virales infecciosas.
  9. Como se indicó anteriormente, el inóculo preparado con el protocolo anterior se utiliza para infectar múltiples matraces de 175 cm2 frascos de cultivo. Repita el protocolo exacto para producir más virus para la purificación. Purifique hasta 180 ml de suspensión viral en un solo ciclo de ultracentrifugación.
  10. Cuando aparezca citopatología, coseche el HRSV raspando las células y recolecte el sobrenadante. Vortexe la suspensión viral. Centrifugue durante 10 min a temperatura ambiente a 1.800 x g para sedimentar los restos celulares. El HRSV presente en el sobrenadante no sedimenta a esta velocidad, por lo que el sobrenadante se alícuota en 15 ml por tubo de 50 ml. Congele rápidamente y almacene a -80 °C hasta la purificación.

2. Purificación de HRSV

Nota: Antes de usar un ultracentrífugo, tenga en cuenta que es un equipo potencialmente peligroso. Lea los manuales y realice la primera centrifugación ultracentrífuga bajo la supervisión de una persona con experiencia.

  1. Limpie los cubos de ultracentrífuga con etanol al 70 % y déjelos secar en una cabina de seguridad biológica.
  2. Coloque un tubo de centrífuga estéril en cada cubo.
  3. Prepare una solución de sacarosa al 30 % (p/v) en solución de PBS, esterilice por filtración (filtro de 0,2 μm) y añada 5 ml en el fondo de cada tubo de centrífuga. Para un protocolo más rápido, los tubos con la solución de sacarosa pueden congelarse. Asegúrese de mantenerlos estériles.
  4. Si la solución de sacarosa no fue congelada, añada cuidadosamente 30 ml de la solución de HRSV encima de la solución de sacarosa. Pipete lentamente para evitar perturbar la solución de sacarosa. Mantenga una clara delimitación. Si los tubos fueron congelados, vierta la suspensión viral encima de la solución de sacarosa congelada y luego déjela descongelar.
  5. Equilibre cuidadosamente los seis cubos de ultracentrífuga con PBS estéril. Coloque la balanza dentro de una cabina de flujo para mantener todo estéril. Llene los tubos hasta 3-5 mm por debajo del borde, de lo contrario los tubos de centrífuga podrían colapsar. Equilibre los cubos con una precisión de 0,1 g e incluya la tapa roscada, por si acaso las tapas no coinciden perfectamente.
  6. Centrifugue en la ultracentrífuga durante 1,5 h a 4 °C y 20.000 rcf.
  7. Retire cuidadosamente el tubo de centrífuga del cubo usando pinzas estériles. Las partículas virales habrán atravesado la capa de sacarosa y formarán un sedimento. Por el contrario, los factores solubles secretados por las células (por ejemplo, citocinas) permanecerán en solución. Incline el tubo de centrífuga para drenar todo el líquido. Déjelo boca abajo sobre una superficie estéril, por ejemplo, una placa de cultivo, para que se seque, pero sin dejar que el sedimento se seque completamente.
  8. Añada cuidadosamente 1 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) al sedimento e incline el tubo de centrífuga para drenar el HBSS. Vuelva a dejar secar el tubo boca abajo sobre una superficie estéril. No permita que el sedimento se seque completamente.
  9. Reconstituya el sedimento en 1 ml de HBSS pipeteando hacia arriba y hacia abajo 40 veces. Trate de evitar la formación de burbujas de aire, ya que esto podría destruir el virus.
  10. Aliquote el virus, congélelo rápidamente en nitrógeno líquido y almacénelo a -80 °C hasta su uso posterior. Utilice un nuevo alícuota de virus para cada experimento, ya que los ciclos repetidos de congelación-descongelación reducirán el título infeccioso. Al descongelar, siempre hágalo a 37 °C, ya que el HRSV es menos estable entre -20 y 15 °C.

3. Cuantificación del HRSV

Nota: Para garantizar datos reproducibles, repita la cuantificación al menos 3 veces por duplicado.

3.1. Infección de células A549

  1. Cultivar células A549 en una placa de 24 pocillos hasta alcanzar confluencia.
  2. Lavar las células A549 dos veces con 1 ml de PBS a temperatura ambiente.
  3. Preparar diluciones seriadas 5 veces de HRSV en medio con suero reducido. Añadir 100 μl del virus diluido a ambos pocillos. Realizar un mínimo de 4 diluciones (por ejemplo: 4, 20, 100 y 500 veces). Incluir dos pocillos adicionales infectados con la mayor dosis de virus (que se utilizarán para el control de isotipo) e incluir dos pocillos mock infectados.
  4. Incubar las células durante 2 h a 5 % de CO2 y 37 °C. Agitar suavemente la placa de 24 pocillos cada 15 min para evitar que se seque.
  5. Eliminar la suspensión de virus y lavar las células una vez con 1 ml de PBS a temperatura ambiente.
  6. Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 4 % (p/v) en medio con suero reducido. Filtrar y esterilizar (filtro de 0,2 μm) y añadir 500 μl a cada pocillo.
  7. Incubar a 5 % de CO2 y 37 °C durante 22 h.

3.2. Preparación para FACS

  1. Retire el medio y lave las células una vez con 1 ml de PBS a temperatura ambiente.
  2. Añada 200 μl de tripsina precalentada (37 °C) a cada pocillo e incube durante 10 min a 37 °C, 5 % CO2.
  3. Revise las células bajo el microscopio para verificar su desprendimiento. Si las células están desprendidas, añada 800 μl de DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S para neutralizar la tripsina. Re_suspenda las células.
  4. Transfiera las células a una placa de 96 pocillos cónica, no tratada para cultivo de tejidos. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. Re_suspenda los sedimentos en 200 μl de PBS frío.
  5. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y re_suspenda en 200 μl de PBS frío.
  6. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y re_suspenda en 150 μl de acetona al 80 %, enfriada con hielo.
  7. Fije las células a temperatura ambiente durante 15 min.
  8. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y re_suspenda en 200 μl de PBS frío + 0,1 % BSA.
  9. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y re_suspenda en 50 μl de anti-NP-RSV-FITC (diluido 1:50 en PBS + 1 % BSA) o en 50 μl de IgG2 anti ratón-FITC (este es un control de isotipo; por lo tanto, use la misma concentración de anticuerpo).
  10. Para el resto del protocolo, mantenga los tubos en la oscuridad. Incube al menos 1 h a 4 °C, aunque puede prolongarse hasta toda la noche.
  11. Añada 150 μl de PBS frío + 0,1 % BSA.
  12. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y re_suspenda en 200 μl de PBS frío + 0,1 % BSA.
  13. Centrifugue durante 5 min a 400 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y re_suspenda en 200 μl de PBS frío + 0,1 % BSA. Mantenga la placa sobre hielo y en la oscuridad hasta la medición por citometría de flujo (FACS).
  14. Mida las células infectadas en un citómetro de flujo.

3.3. Cálculo de FITC-50

  1. Utilice un programa de análisis de citometría de flujo para establecer el punto de corte usando el control negativo (control de isotipo). Utilice el tipo de gráfico Pseudocolor. Dibuje una puerta cuadrante, donde las células positivas se encuentren en el cuadrante Q3. El porcentaje de falsos positivos debe ser inferior al 0,2 % en ambos controles de isotipo.
  2. Exporte los datos a un programa de hojas de cálculo y prepare una tabla con el porcentaje de células FITC+ para cada dilución. Reste el valor promedio de falsos positivos (determinado mediante el control de isotipo) a cada valor correspondiente a cada experimento.
  3. Abra un nuevo archivo (dispersión XY, una columna X y múltiples columnas Y) en un programa estadístico. Copie los datos a este programa: X = dilución, Y = % de células infectadas, n = 3; utilice el promedio de dos mediciones para cada dilución. Realice una regresión no lineal con análisis estadístico de decaimiento exponencial de una fase. Verifique si la curva se ajusta a los puntos de datos; si no es así, elija un análisis estadístico diferente.
  4. Copie la ecuación de la curva y los valores correspondientes a la ecuación en un programa de hojas de cálculo. Calcule el valor de X cuando Y = 50 %. Determine entonces el valor FITC-50 calculando las Partículas Infecciosas Detectadas por FITC/ml (FIP/ml) en la dilución en la que se presenta una infección del 50 %, utilizando la siguiente ecuación:
    Fórmula de cálculo de FITC50; diagrama que ilustra la ecuación de medición de intensidad de fluorescencia.
    A = número promedio de células A549 por pocillo
    B = μl de virus por pocillo utilizados para la infección
    C = dilución en la que se presenta el 50 % de infección

4. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre de voluntarios sanos

  1. Extraiga sangre venosa en tubos de 10 ml con EDTA de voluntarios sanos tras obtener su consentimiento informado. Un volumen de 10 ml de sangre producirá aproximadamente 107 PBMCs.
  2. A partir de ahora, trabaje de forma estéril en una cabina de flujo laminar.
  3. Diluya la sangre 2 veces con PBS a temperatura ambiente en un tubo de 50 ml. Por cada tubo de 50 ml, se puede usar un volumen total máximo de 35 ml de sangre diluida.
  4. Tome una jeringa estéril de 50 ml y coloque una aguja Luer lock esterilizada. Aspire medio de gradiente de densidad en la jeringa. Coloque la aguja en el fondo de un tubo con sangre diluida y pipetee cuidadosamente 15 ml de medio de gradiente de densidad debajo de la sangre diluida. Mantenga una delimitación clara entre el medio de gradiente de densidad y la sangre.
  5. Centrifugue a 800 x g durante 20 min a temperatura ambiente, con aceleración en 9 (máxima) y sin freno. Después del uso, configure la temperatura de la centrífuga a 4 °C.
  6. La centrifugación en gradiente de densidad dará como resultado múltiples capas. En el fondo se encuentra un sedimento con eritrocitos, con una capa plateada encima que contiene los neutrófilos. La capa clara por encima de este sedimento contiene el medio de gradiente de densidad. Una capa delgada entre el medio de gradiente de densidad y la capa superior de plasma sanguíneo contiene los PBMCs.
  7. Recopile cuidadosamente los PBMCs con una pipeta de Pasteur y transfiera las células a un tubo nuevo de 50 ml. A partir de ahora, mantenga los PBMCs sobre hielo y use PBS frío con hielo. Añada PBS frío con hielo hasta un volumen de 50 ml y centrifugue a 400 x g durante 10 min a 4 °C (con el freno ajustado en 9).
  8. Deseche el sobrenadante por aspiración, resuspenda el sedimento en 50 ml de PBS frío con hielo y centrifugue a 400 x g durante 10 min a 4 °C; repita el proceso 2 veces.
  9. Tras desechar el sobrenadante, añada 1 ml de medio frío con hielo (RPMI + 1% P/S) y cuente las células utilizando una cámara de recuento.
  10. Ajuste la concentración celular a 5 x 106 PBMCs/ml.

5. Estimulación de PBMC con HRSV vivo

  1. Prepare un montaje del experimento; incluya réplicas experimentales para cada condición.
  2. Diluya todos los estímulos necesarios en medio (RPMI + 1% P/S). Tenga en cuenta que el volumen final por pocillo será de 200 μl. Se añadirán 50 μl de estímulos, por lo que debe preparar soluciones madre de estimulación 4 veces más concentradas.
  3. Añada 100 μl de la suspensión celular mencionada anteriormente a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo (5 x 105 PBMC/pocillo).
  4. Añada 50 μl de los estímulos diluidos a cada pocillo. Es posible añadir dos estímulos diferentes, lo que da un volumen total de 200 μl. Si solo se necesita un estímulo, ajuste el volumen a 200 μl con medio.
  5. Incube la placa de 96 pocillos durante el período de incubación requerido a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Para la mayoría de las citocinas, un periodo de incubación de 24 horas será suficiente.

6. Lectura de la estimulación

  1. Después del período de incubación, centrifugar la placa de 96 pocillos durante 5 min a temperatura ambiente a 450 x g para recoger las células en el fondo.
  2. Recoger el sobrenadante (tomar un volumen máximo de 180 μl) y almacenarlo para el análisis posterior de citocinas (-20 °C) o para la producción de virus (-80 °C).
  3. Los PBMC estimulados que están presentes en el sedimento pueden analizarse mediante qPCR o blot de Western añadiendo tampón de lisis, o alternativamente, los PBMC pueden teñirse para el análisis por citometría de flujo.

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Resultados

El método de cultivo y purificación de HRSV A2 descrito aquí proporcionará un rendimiento entre 2 x 107 y 2 x 108 partículas virales infecciosas cuantificadas por FITC-50/ml. Los resultados del análisis microscópico, en el que se contaron células infectadas teñidas con FITC (resultados no mostrados), se compararon con los resultados de la cuantificación mediante FACS (Figura 1). Ambos métodos arrojaron títulos similares, aunque el método de FACS presentó una desviación estándar much...

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Discusión

En este estudio, demostramos que la infección de PBMC con HRSV es un sistema modelo rápido y confiable en el que se pueden estudiar las vías inflamatorias. Para estimular las PBMC, se debe preparar y cuantificar una acción de HRSV.

Múltiples líneas celulares son susceptibles a la infección por HRSV. Las líneas celulares más utilizadas para el cultivo de HRSV son las células HEp-2, HeLa y Vero. Sin embargo, no recomendaríamos el uso de células Vero para el cultivo del HRSV porque se ha demostra...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

RSV A2 fue amablemente proporcionado por el Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Países Bajos). MV y GF cuentan con el apoyo del consorcio Virgo, financiado por el proyecto número FES0908 del gobierno holandés, y por el proyecto número 050-060-452 de la Iniciativa Genómica de los Países Bajos (NGI). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo
PBSLonzaBE17-516FPBS sin Ca2+ Mg2+ o rojo fenol
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, Calcio, Magnesio, sin Fenol Rojo
DMEMInvitrogen31966-047DMEM, Alto Glucosa, GlutaMAX, Piruvato
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (Fetal Bovine Serum)
BSASigma AldrichA7030Albúmina de suero bovino
P/SInvitrogen15140-122Penicilina-Estreptomicina,
tripsinaInvitrogen25300-0540.05% Tripsina-EDTA (1x), Fenol Rojo
Células HeLaCélulas ATCCCCL-2
A549ATCCCCL-185
SacarosaSigma AldrichS7903Sacarosa BioXtra, ≥ 99,5%
IgG2 anti-ratón-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K Control de isotipos FITC
Anti-NP-RSV-FITCAbcamab25849Anticuerpo anti-virus respiratorio sincitial [671] (FITC)
Medio de gradiente de densidad (Lymphoprep)Tubos de1114545
EDTAAxis-Shield BD Biosciences367525
AcetonaMerck Millipore1000141000Acetona para análisis
Material
Tubos centrífugosBeckman Coulter326823Pared fina, Polialómero, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm
Rotor SureSpin 630 con cubos de 36 mlSorvall79368Cuchara oscilante rotor de titanio
Sorvall WX80 Ultracentrífuga Sorvall46900
CB 150l CO2Aglutinante
líquida de incubadora

Referencias

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