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Artículo de método

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

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DOI:

10.3791/50821

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15 de octubre de 2013

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Hemos desarrollado un ensayo in vitro para investigar el papel de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH.

Resumen

El agotamiento de las células T es un factor importante para la remoción de patógenos fallado durante las infecciones virales crónicas. Vías inmunorreguladoras, como PD-1 e IL-10, se upregulated en esta exposición al antígeno en curso y contribuyen a la pérdida de la proliferación, la función citolítica reducida, y el deterioro de la producción de citocinas por las células T CD4 y CD8. En el modelo murino de infección de LCMV, la administración de anticuerpos de bloqueo contra estos dos vías aumentada respuestas de células T. Sin embargo, actualmente no existe un ensayo in vitro para medir el impacto de tales bloqueo sobre la secreción de citoquinas en las células a partir de muestras humanas. Nuestro protocolo y el enfoque experimental nos permiten cuantificar con precisión y eficiencia de la restauración de la producción de citocinas por las células específicas del VIH T CD4 de los sujetos infectados por el VIH.

Aquí, representamos un diseño experimental in vitro que permite mediciones de la secreción de citocinas por las células específicas del VIH T CD4 y su impacto en otros cell subconjuntos. Las células T CD8 se agotaron de la sangre total y el resto de PBMCs se aislaron mediante método de separación Ficoll. PBMC CD8-empobrecido fueron incubadas con anticuerpos de bloqueo contra PD-L1 y / o IL-10Rα y, después de la estimulación con una piscina péptido Gag del VIH-1, las células se incubaron a 37 ° C, 5% de CO 2. Después de 48 horas, se recogió el sobrenadante para el análisis de citoquinas por las cuentas de las matrices y los sedimentos celulares se recogieron, ya sea para el análisis fenotípico mediante citometría de flujo o análisis transcripcional mediante QRT-PCR. Para un análisis más detallado, diferentes poblaciones de células se obtuvieron por el agotamiento del subconjunto selectiva a partir de PBMCs o por clasificación mediante citometría de flujo antes de ser evaluados en los mismos ensayos. Estos métodos proporcionan un enfoque altamente sensible y específico para determinar la modulación de la producción de citoquinas por las células T auxiliares específicas de antígeno y para determinar las interacciones funcionales entre diferentes poblaciones de células inmunes.

Introducción

Durante las infecciones virales persistentes, las células T específicas de virus adquieren defectos funcionales en un proceso conocido como agotamiento de células T. A principios de los estudios in vivo en el modelo murino de LCMV infección viral crónica indican que las células T específicas del virus agotados han reducido la función citolítica contra las células infectadas por virus, pierden su capacidad de proliferar y han reducido la capacidad de producir citocinas como la IL-2, TNF- α e IFN-γ 1,2. Una compleja red de vías inmunorreguladoras, tal como Pd-1 e IL-10, se regula positivamente durante las infecciones crónicas y contribuir a la disfunción de células T (revisado en 3,4). La administración in vivo de anticuerpos de bloqueo contra estos vías inhibitorias en el ratón de LCMV modelo de la función de las células T específicas del virus agotadas y la eliminación del virus mejorada restaurado, lo que indica que el agotamiento de las células T es un fenómeno parcialmente reversible (revisado en 5).

Los hallazgos en thmodelo de LCMV correo se extendió rápidamente a las infecciones virales crónicas humanas tales como el VHB, el VHC y el VIH 5. En crónica por el VIH-1 infección, PD-1 e IL-10 vías están regulados por incremento en los sujetos infectados y se correlacionan con parámetros de progresión de la enfermedad, directamente con la carga viral e inversamente con el recuento de CD4 6-8. Bloqueo de anticuerpos de la PD-1 o IL-10 en la proliferación in vitro vías restaurado de las células específicas del VIH T CD4 y CD8 que indican que, similar al modelo de LCMV ratón, agotamiento de células T en los seres humanos es un fenómeno parcialmente reversible. Sin embargo, debido a la delicada naturaleza de los experimentos sobre muestras humanas, así como limitaciones en la sensibilidad de los ensayos in vitro, la investigación a fondo de los perfiles de restauración funcionales conseguidos por estas intervenciones es sorprendentemente ausente. Los ensayos de proliferación han sido, hasta ahora, el único ensayo fiable in vitro probado en la mayoría de los estudios, sin embargo, hay una notable falta de evidencia sobre el impacto de estos interintervenciones en: 1) la capacidad de destrucción de células T citotóxicas, 2) el efecto antiviral de células T en la replicación viral, 3) el perfil de secreción de citoquina, y 4) el efecto de la ayuda de células T CD4 en otros subgrupos de células.

Tinción intracelular de citoquinas (ICS) es una herramienta muy útil y ampliamente utilizado ensayo basado en citometría de flujo que se utiliza para detectar la producción de citoquinas en diversos tipos de células en ratones y seres humanos. También se ha utilizado para investigar el efecto de bloqueo de anticuerpos de las vías inhibitorias. En los ensayos de partida de la ICS, la secreción de citoquinas es bloqueado por la adición de Brefeldina y / o monensina. Las citoquinas atrapados dentro de las células se detectaron con anticuerpos fluorescentes utilizando citometría de flujo policromática. La duración del ensayo se limita generalmente a 6 o 12 h después de la estimulación antigénica, ya que ambos Brefeldina y monensina, que se añaden típicamente dentro de 2 h de la adición de antígeno, son tóxicos para las células. El ensayo ICS es una poderosa técnica que ha sido i útiln la investigación del efecto de la administración in vivo de bloqueo de la intervención de anticuerpos en ratones en los que se extraen las células después de un cierto período de tiempo después de la exposición anticuerpo 9. Sin embargo, hay varias limitaciones para la aplicación de este enfoque experimental para evaluar el impacto de bloqueo de los receptores inhibitorios en muestras humanas. Al realizar intervenciones de anticuerpos de las vías inhibitorias en una hora estimulación 6 o 12 in vitro (normalmente el caso con muestras humanas), bloqueo de los receptores inhibitorios en la mayoría de los casos no altera la frecuencia de responder las células T específicas de antígeno tal como se mide mediante ensayos estándar de ICS 6, 7. Las mediciones de la producción de citoquinas por células, medida por la intensidad media o la mediana de la fluorescencia han dado resultados inconsistentes 6, 7, 10. Por otro lado, cuando ICS se realiza en un punto de tiempo finales después de la estimulación (es decir, seis días), los cambios en el número de citoquinas que secretan Cells se pueden observar. Las diferencias son un efecto combinado de la proliferación alterada, la supervivencia, y los cambios en la función efectora que se acumulan durante el período de tiempo especificado 6. Una forma de superar parcialmente estas limitaciones es incubar durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, 36 h, 60 h, etc.) Con el antígeno antes de la adición del bloqueante de la secreción de citoquinas, sin esperar a que se produzca la proliferación. Hemos utilizado con éxito este método para determinar la cinética de la secreción de citoquinas por las células específicas del VIH T CD4 y CD8 11,12; sin embargo, este enfoque no es capaz de detectar pequeñas respuestas y no dará un resultado integrado de la secreción total de citoquinas que ocurre ya que la estimulación. Por lo tanto, ICS no es un método lo suficientemente sensible para detectar el impacto de bloqueo de las vías inhibitorias de la cantidad de citocinas producidas por las células T activadas en comparación con mRNA de citoquinas cuantificación o mediciones de la secreción de citoquinas en el supernatant en los mismos puntos de tiempo. Además, la mayoría de las citoquinas producidas por las células T activadas actúan en forma autocrina por contribuir a la retroalimentación positiva o negativa bucles a través de la interacción con las células presentadoras de antígeno. Por lo tanto, la adición de Brefeldina o monensina durante el ensayo ICS impide la secreción de citoquinas y por lo tanto la estimulación de las células T no es óptima. Finalmente, la detección de múltiples citoquinas con ICS está limitado por la disponibilidad y la sensibilidad de los anticuerpos para la detección de citoquinas con citometría de flujo, así como por las limitaciones en el número de fluorocromos que pueden ser utilizados simultáneamente en cualquier panel dado.

Desarrollamos un método de alta sensibilidad in vitro experimental para evaluar el impacto de las vías inmunorreguladoras en la regulación de la secreción de citocinas por las células específicas del VIH T CD4 y posteriormente ayuda CD4 a células presentadoras de antígenos (CPA) y las células asesinas naturales (células NK). Este método también se puede utilizar para evaluar la IMPAct del bloqueo de las moléculas inhibidoras sobre la función de las células T CD8 de ozono las células T CD4 de PBMCs o mediante la estimulación con péptidos óptimos que son reconocidos sólo por las células T CD8. En contraste con los ensayos de tinción intracelular de citoquinas, hemos decidido no interferir con la secreción de citoquinas por las células-T CD4 específicas del VIH con el fin de ser capaz de: 1) realizar una cuantificación más precisa de los niveles de citoquinas producidas; 2) investigar un panel más amplio de citocinas o moléculas efectoras, y 3) evaluar el impacto de las citoquinas producidas por las células específicas del VIH CD4 T en otros subconjuntos de células. Estimulamos CD8 PBMC empobrecido con un VIH-1 Gag péptido piscina en la presencia de anticuerpos de bloqueo para la vía inmunorreguladora de interés. Después del tiempo deseado de incubación, por lo general 48 horas, recogemos los sobrenadantes para medir la secreción de citoquinas con matrices de perlas y recoger los gránulos de las células, ya sea para el análisis fenotípico de los diferentes subconjuntos de células o para el análisis de la transcripción. Es de destacar que en tsu punto de tiempo 48 horas, no se detecta una población significativa de la proliferación de las células T 12. Este es un enfoque flexible y varias adaptaciones de este diseño se puede aplicar para hacer frente a diferentes hipótesis. Por ejemplo, los subconjuntos de células individuales (tales como las células-T CD4 específicas del VIH o de PD-1 de células de alta T CD4, etc.) Se pueden ordenar después de 12 horas de incubación antes de una incubación adicional durante 36 horas seguido por la recolección de los sobrenadantes y sedimentos celulares para investigar más específicamente el impacto de las intervenciones del bloqueo sobre la secreción de citoquinas por las subpoblaciones definidas de PBMCs.

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Protocolo

1. El agotamiento y aislamiento de PBMCs mediante Ficoll separación

  1. Agotar las células T CD8 + mediante la adición de humano CD8 + cóctel de agotamiento en 50 l / ml de sangre entera.
  2. Mezclar bien e incubar durante 20 min a temperatura ambiente (18-25 ° C).
  3. Después de la incubación, la mezcla de sangre entera con HBSS (solución salina equilibrada de Hank sin Ca 2 + o Mg 2 +) y la capa sobre Histopaque. Girar a 340 rcf durante 30 min (sin freno, aceleración lenta).
  4. Recoger PBMCs y transferirlos a un nuevo cónico de 50 ml. Lavar 2x con 45 ml de RPMI 1640 suplementado con 50 UI de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, y 1% de HEPES haciendo girar durante 10 minutos a 340 RCF.

2. El bloqueo de anticuerpos y la estimulación de antígeno específico de células

  1. Resuspender las células en 2x10 6 por condición en medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero humano suplementado con 50 UI de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, y 1% de HEPES,representando el 500 l por condición.
  2. Alícuota de 500 l de suspensión de células por tubo de FACS.
  3. Dependiendo de la vía investigado, añadir PD-L1, el bloqueo de anticuerpos y / o controles de isotipo a 10 mg / ml de IL-10Rα y se incuba durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
  4. Estimular las células con una piscina péptido del VIH-1 de la mordaza a una concentración final 1 mg / ml / péptido. También incluya un control "sin estimulación" para cada condición de bloqueo. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.

3. Recolección y Análisis de sobrenadante

  1. Después de 48 horas, centrifugar los tubos de FACS durante 7 minutos a 340 RCF.
  2. Recoger cuidadosamente el 2 x 225 l sobrenadante en tubos Eppendorf para matrices de perlas Luminex sin perturbar el sedimento.
  3. Inactivar virus en el sobrenadante recogido con 25 l 0,5% de PBS-Tween para dar una concentración final de 0,05% de PBS-Tween.
  4. Tienda recogido sobrenadantes que no son immediately utilizado en un -80 ° C congelador.
  5. Mida las concentraciones de citoquinas deseados utilizando el kit de Millipore Luminex según el protocolo del fabricante.

4. Recopilación y análisis fenotípico de las células a través de citometría de flujo

  1. Después de recoger el sobrenadante, lavar las células en PBS 3ml. Haga girar las células durante 7 minutos a 340 RCF y decantar el exceso de lavado.
  2. Stain para la viabilidad usando un kit de tinción celular Dead VIVO / DEAD reparable según el protocolo del fabricante.
  3. Lavar las células en PBS durante 7 minutos a 340 RCF y a 4 ° C. Resuspender en 100 l de PBS 1% de FBS.
  4. Si la tinción de monocitos u otras células presentadoras de antígenos, receptores Fc bloque mediante la adición de 1,4 l de FcR reactivo de bloqueo y agitar para mezclar.
  5. Incubar durante 10 min a 4 ° C.
  6. Añadir anticuerpos de superficie, vórtice, y se incuba durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
  7. Lavar las células con PBS 1% de SFB, se decanta el exceso de lavado, y añadir 200 l 4% de paraformaldehído. Incubara temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
  8. Lavar las células con PBS 1% de SFB, resuspender en 250 l de PBS 1% de SFB, y adquirir en un multilaser citómetro de flujo (por ejemplo, BD LSRII o Fortessa).

5. Análisis de las células a través de QRT-PCR

  1. Para las células no se analizaron por medio de citometría de flujo: después de la recogida de sobrenadante, las células se lisan en 300 l RLT Qiagen Buffer que contiene 1% de beta-mercaptoetanol. Si no continuar con el protocolo, las células se pueden congelar a -80 ° C después de este punto.
  2. Aislar el ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN siguiendo el protocolo del fabricante.
  3. Sintetizar de ADNc a partir de ARN usando un kit de síntesis de ADNc siguiendo el protocolo del fabricante.
  4. Realizar PCR cuantitativa utilizando la tecnología de SYBR Green.
  5. Crear una mezcla de cebadores para cada cebador utilizado incluyendo genes de mantenimiento (por ejemplo, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) mediante la adición de cebadores de nucleasa libre de agua para dar una concentración final de 10M. Mantener en hielo.
  6. Crear una mezcla maestra para cada cebador mediante la adición de 10,5 l de nucleasa libre de agua, 12,5 l SYBR verde, y 1 l mezcla de cebadores por plato también. Mantener en hielo.
  7. Pipeta mezcla maestra 24 l en cada pocillo de la placa que se utilizará.
  8. Añadir 1 l de cDNA a cada pocillo de acuerdo con la plantilla.
  9. Tapar los pozos y la placa se centrifuga durante 3 minutos a 800 RCF.
  10. Ejecute la placa en una máquina de QRT-PCR, por ejemplo, un instrumento Stratagene Mx3005P.

6. Adaptación para intracelular de citoquinas tinción a las 48 h

Añadir Brefeldina y monensina 6 horas antes de la tinción intracelular de citoquinas. Brefeldina se añade a una concentración de 10 microgramos / ml, mientras que la monensina se añade según las instrucciones del fabricante. Por conveniencia, se puede añadir Brefeldina 12 h antes de manchar a una concentración de 5 g / ml.

  1. Después de la mancha de la superficie, lavar las células con PBS 1% de SFB y las manchas en elcitocinas extracelulares tales como IL-12, IFN-γ, y TNF-α usando un kit de solución de fijación / permeabilización y el protocolo.
  2. Lavar las células, resuspender en 250 l de PBS 1% de SFB, y se ejecutan en un multilaser citómetro de flujo (por ejemplo, BD LSR II o Fortessa).

7. Adaptación para ordenar celdas

  1. 16 horas después de la estimulación, la mancha para la viabilidad usando VIVO / DEAD corregible Kit Stain Dead Cell según el protocolo del fabricante. Mantener las células en hielo durante todo el procedimiento.
  2. Lavar las células con PBS durante 7 minutos a 340 RCF y a 4 ° C. Resuspender en 100 l de PBS 1% de FBS.
  3. Añadir anticuerpos de superficie, mezclar en vórtex, y se incuba células en hielo en la oscuridad durante 20 min.
  4. Lavar las células con PBS 1% de FBS a 340 RCF y a 4 º C y resuspender en 500 l de RPMI 1640 frío que contiene 10% de suero bovino fetal suplementado con 50 UI de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, y 1% HEPES.
  5. Las células de filtro utilizando 5 ml Polystyrene Tubo de fondo redondo con tapa de la celda-colador.
  6. Preparar tubos de recogida para ordenar por la adición de 200 l de RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal suplementado con 50 UI de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, y 1% de HEPES a cada tubo. Mantenga todos los tubos en hielo durante la clase.
  7. Ordenar en vivo los subconjuntos de células de interés en un instrumento (por ejemplo, BD FACS Aria II), ubicado en un centro equipado para material de riesgo biológico.
  8. Después las células se han ordenado, células de lugar atrás en la incubadora durante el tiempo deseado y seguir con el análisis de la colección sobrenadante / Luminex y análisis colección sedimento celular / PCR.

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Resultados

Para realizar las mediciones de citoquinas utilizando este sistema in vitro, que es esencial para ser capaz de distinguir las respuestas específicas de antígeno en comparación con el control sin estimulación. En general, se consideraron respuestas positivas como los valores de la estimulación antigénica que dan aumento de al menos de tres veces en los niveles de citoquinas en comparación con el control sin estimulación y que estaban dentro del rango lineal del ensayo. Estamos utilizando la sensibilidad de ensay...

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Discusión

Colección sobrenadante es una parte imprescindible de este diseño experimental. Cuando la recolección de sobrenadantes para el ensayo Luminex, se hicieron alícuotas y se mantuvieron a -80 ° C para evitar la degradación de la proteína debido a los ciclos de congelación-descongelación. La congelación y descongelación puede ser procesos difíciles para las proteínas, y al minimizar el congelamiento de los deshielos, la señal se maximizará en ensayos. Por lo tanto, es más fácil obtener datos repetible y más precisa cuando se...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Damos las gracias a Gordon Freeman para proporcionar el bloqueo de anticuerpos anti-PD-L1. Damos las gracias al personal clínico y de laboratorio en el Hospital General de Massachusetts y todos los participantes en el estudio por su inestimable papel en este proyecto.

Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de la Salud (PO1 AI-080192; DEK), el Nacional del Corazón Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud (RO1 HL-092565; DEK). DEK es apoyado por un premio Career Research Scholar del Fondo de Investigación Sanitaria Quebec (FRQS). FP es apoyado por una beca de la Comisión Ejecutiva del Hospital general de Massachusetts en la Investigación y el Instituto de Salud Global de la Universidad de Harvard (HGHI).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina equilibrada Hanks sin Ca2+ o Mg2+SigmaH9394
RPMI 1640SigmaR0883
Histopaque-1077Sigma10771
Suero humano ABGemini BioProducts100-512
Penicilina/EstreptomicinaMediatech30 001 CI
L-glutaminaMediatech25 005 CI
Tampón HEPESMediatech25060CI
FcR reactivo de bloqueo, humanoMiltenyi130-059-901
RosetteSep Humano CD8+ Cóctel de depleción Stem Cell15663
LIVE/DEAD Kit de manchas de células muertas reparables, para excitación UVInvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Improm-II Sistema de transcripción inversaPromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Cytofix/Cytoperm Kit de solución de fijación/permeabilizaciónBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN-γ imprimaciónInvitrogenFOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primerInvitrogenFOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

Referencias

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