Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones adultos para estudiar la encefalomielitis autoinmune experimental. Estas ventanas proporcionan acceso óptico crónico a la médula espinal para monitorear la dinámica celular a nivel subcelular en animales vivos utilizando microscopía de dos fotones.
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Artículo de método
Implante de ventanas de vidrio de la médula espinal en ratones adultos con encefalomielitis autoinmune experimental
En este artículo
Resumen
Resumen
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en roedores adultos es el modelo experimental estándar para estudiar enfermedades desmielinizantes autonómicas como la esclerosis múltiple. En este trabajo presentamos un protocolo de implante de ventana de vidrio de bajo coste y reproducible, adecuado para la microscopía intravital y el estudio de la dinámica de la citoarquitectura de la médula espinal con resolución subcelular en ratones adultos vivos con EAE. Brevemente, exponemos quirúrgicamente las vértebras T12-L2 y construimos una cámara alrededor de las vértebras expuestas utilizando una combinación de cianoacrilato y cemento dental. Se realiza una laminectomía desde T13 hasta L1, y se aplica una fina capa de elastómero de silicona transparente en la superficie dorsal de la médula espinal expuesta. Se implanta un cubreobjetos de vidrio modificado sobre la médula espinal expuesta, teniendo cuidado de que el vidrio no entre en contacto directo con la médula espinal. Para reducir la infiltración de células inflamatorias entre la ventana y la médula espinal, se administra tratamiento antiinflamatorio cada 2 días (según lo recomendado por el comité de ética) durante los primeros 10 días después de la implantación. La EAE se induce solo 2-3 semanas después del cese del tratamiento antiinflamatorio.
Utilizando este enfoque, indujimos con éxito EAE en el 87% de los animales con ventanas implantadas y, utilizando ratones Thy1-CFP-23 (axones azules en la médula espinal dorsal), cuantificamos la pérdida axonal a lo largo de la progresión de EAE. En conjunto, este protocolo puede ser útil para estudiar el reclutamiento de varias poblaciones celulares, así como su dinámica de interacción, con resolución subcelular y durante largos períodos de tiempo. Esta modalidad de imagen intravital representa una valiosa herramienta para el desarrollo de estrategias terapéuticas en el tratamiento de enfermedades desmielinizantes autoinmunes como la EAE.
Introducción
La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune del SNC que causa daño progresivo en la mielina y los axones. El modelo de investigación estándar para las enfermedades desmielinizantes autoinmunes del SNC es la EAE en roedores adultos. Sin embargo, los eventos celulares dinámicos que subyacen a la progresión de la EAE siguen siendo en gran medida inexplorados. Un enfoque consiste en utilizar la microscopía intravital de dos fotones para visualizar poblaciones celulares con marcadores fluorescentes durante largos períodos de tiempo en la médula espinal de ratones adultos con EAE.
La microscopía intravital de dos fotones es una forma pode....
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Protocolo
1. Preparación de la ventana y la estructura de soporte
- Preparación de la ventana: prepare varias ventanas de varios tamaños (ancho = 1,8-2,2 mm; longitud = 4,5-5,2 mm) para la implantación.
- Haciendo la rebaba de taladro modificada para cortar el vidrio de la cubierta: usando una cantidad generosa de cemento dental, fije una rebaba de taladro a un eje (en nuestro caso, abrazaderas Bulldog viejas). Asegúrese de que la rebaba esté a ~45° en relación con el eje para facilitar su manejo.
Nota: los escribas de diamante también funcionan bien para cortar vidrio de cubierta. - Hacer la diapositiva A: con un portaobjetos de microscopio....
- Haciendo la rebaba de taladro modificada para cortar el vidrio de la cubierta: usando una cantidad generosa de cemento dental, fije una rebaba de taladro a un eje (en nuestro caso, abrazaderas Bulldog viejas). Asegúrese de que la rebaba esté a ~45° en relación con el eje para facilitar su manejo.
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Resultados
El uso de ventanas de vidrio implantadas crónicamente en combinación con microscopía intravital de dos fotones y modelos de EAE podría ser una herramienta útil para comprender los mecanismos celulares que subyacen a la patología de las enfermedades autoinmunes desmielinizantes. Mediante nuestro método de implantación, descubrimos que la mayoría de las ventanas estaban claras al momento de la inducción de EAE y permanecieron claras durante toda la progresión de la enfermedad (Figura 1c). Con este enfoque,.......
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Discusión
Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre las médulas espinales expuestas de ratones adultos para estudiar la progresión dinámica de EAE a lo largo del tiempo. Se ha utilizado un enfoque similar de implantación de ventanas de vidrio para estudiar modelos de lesión de la médula espinal13 y también puede ser útil para estudiar otras patologías de la médula espinal como glioblastomas, meningitis o la fisiología celular de la médula espinal normal. Para nuestro método, la estabilizac.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen y S. Meijia-Gervacio por sus útiles debates; M. Hocine y C. Meunier, y al personal de las instalaciones de imágenes de animales y PicSIL del IBDML para el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por una subvención institucional del Centre National de la Recherche Scientifique, y por subvenciones de la Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (a G.R. y K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (a FD). K.K.F. contó con el apoyo de una beca de la ARSEP. Las imágenes se realizaron en el centro de im....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Taladro de extracción de hueso | World Precision Instruments | IDEAL MICRO-DRILL | También vendido por Harvard Apparatus. Cualquier taladro de hueso quirúrgico de alta calidad será suficiente. |
| Fresa de perforación (# 1/4 o 1/2 fresa redonda de carburo) | World Precision Instruments | 501860 (#1/4) 501860 (#1/2) | También vendido por Harvard Apparatus |
| Staples | Lyreco | 5.002.567 | Corona = 8 mm Pata = 4 mm |
| Clip | Cualquier clip estándar de 25 mm | ||
| Destornilladores de agujas | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Tijeras de | papelHerramientas de ciencia fina | 14028-10 | |
| Pinza Adson | Herramientas de ciencia fina | 11027-12 | 1 x 2 dientes |
| Pinzas romas | Herramientas de ciencia fina | 11293-00 | |
| Horquillas espinales | Aparato Harvard | 724813 | |
| Cemento dental | GACD | 12-565 & 12-568 | |
| Elastómero de silicona | World Precision Instruments | KWIK-SIL | También disponible a través de Coherent Scientific y Fisher Scientific |
| Cianoacrilato | Eleco-EFD | Cyanolit 201 | |
| Microscopio | Zeiss | 7MP | Nuestro microscopio está en configuración vertical y está equipado con 5 detectores NDD. |
| Objetivo | Zeiss | W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm Distancia de | trabajo = 1,8 mm |
Referencias
- Kim, J. V., Dustin, M. L. Innate response to focal necrotic injury inside the blood-brain barrier. J. Immunol. 177 (8), 5269-5277 (2006).
- Xu, H. -T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. -B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic sp....
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Reimpresiones y permisos
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