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Artículo de método

Implante de ventanas de vidrio de la médula espinal en ratones adultos con encefalomielitis autoinmune experimental

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DOI:

10.3791/50826

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21 de diciembre de 2013

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, 2Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

En este artículo

Resumen

Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones adultos para estudiar la encefalomielitis autoinmune experimental. Estas ventanas proporcionan acceso óptico crónico a la médula espinal para monitorear la dinámica celular a nivel subcelular en animales vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en roedores adultos es el modelo experimental estándar para estudiar enfermedades desmielinizantes autonómicas como la esclerosis múltiple. En este trabajo presentamos un protocolo de implante de ventana de vidrio de bajo coste y reproducible, adecuado para la microscopía intravital y el estudio de la dinámica de la citoarquitectura de la médula espinal con resolución subcelular en ratones adultos vivos con EAE. Brevemente, exponemos quirúrgicamente las vértebras T12-L2 y construimos una cámara alrededor de las vértebras expuestas utilizando una combinación de cianoacrilato y cemento dental. Se realiza una laminectomía desde T13 hasta L1, y se aplica una fina capa de elastómero de silicona transparente en la superficie dorsal de la médula espinal expuesta. Se implanta un cubreobjetos de vidrio modificado sobre la médula espinal expuesta, teniendo cuidado de que el vidrio no entre en contacto directo con la médula espinal. Para reducir la infiltración de células inflamatorias entre la ventana y la médula espinal, se administra tratamiento antiinflamatorio cada 2 días (según lo recomendado por el comité de ética) durante los primeros 10 días después de la implantación. La EAE se induce solo 2-3 semanas después del cese del tratamiento antiinflamatorio.

Utilizando este enfoque, indujimos con éxito EAE en el 87% de los animales con ventanas implantadas y, utilizando ratones Thy1-CFP-23 (axones azules en la médula espinal dorsal), cuantificamos la pérdida axonal a lo largo de la progresión de EAE. En conjunto, este protocolo puede ser útil para estudiar el reclutamiento de varias poblaciones celulares, así como su dinámica de interacción, con resolución subcelular y durante largos períodos de tiempo. Esta modalidad de imagen intravital representa una valiosa herramienta para el desarrollo de estrategias terapéuticas en el tratamiento de enfermedades desmielinizantes autoinmunes como la EAE.

Introducción

La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune del SNC que causa daño progresivo en la mielina y los axones. El modelo de investigación estándar para las enfermedades desmielinizantes autoinmunes del SNC es la EAE en roedores adultos. Sin embargo, los eventos celulares dinámicos que subyacen a la progresión de la EAE siguen siendo en gran medida inexplorados. Un enfoque consiste en utilizar la microscopía intravital de dos fotones para visualizar poblaciones celulares con marcadores fluorescentes durante largos períodos de tiempo en la médula espinal de ratones adultos con EAE.

La microscopía intravital de dos fotones es una forma poderosa de estudiar la fisiología celular, las interacciones celulares y la progresión dinámica de la enfermedad en animales vivos con resolución subcelular1. Sin embargo, un obstáculo importante para el enfoque es que requiere acceso óptico a la región de interés. Por ejemplo, las ventanas de vidrio craneal son una metodología bien establecida para obtener imágenes repetidas de las mismas microestructuras en el cerebro durante varias semanas2,3. Sin embargo, la adaptación de esta metodología a la imagen de la médula espinal no es sencilla y requiere varias modificaciones técnicas para inmovilizar el tejido dorsal de la columna vertebral dentro de las vértebras articuladas.

Anteriormente, el acceso óptico a la médula espinal requería reexponer quirúrgicamente la médula espinal al comienzo de cada sesión de imágenes y suturar la piel cerrada al final de cada sesión4-12. Estas cirugías repetidas son traumáticas para el animal, limitan el número y la duración de las sesiones de diagnóstico por imágenes y aumentan la probabilidad de artefactos relacionados con la cirugía, como inflamación y daño a la médula espinal a través de perturbaciones mecánicas. Para superar estas deficiencias, recientemente desarrollamos un protocolo para implantar ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones transgénicos fluorescentes adultos con lesiones traumáticas de la médula espinal para experimentos de microscopía de dos fotones in vivo a largo plazo sin cirugías repetidas13. En este trabajo se presenta una adaptación detallada del protocolo de implantación en el contexto de su aplicación para estudiar los eventos celulares dinámicos que subyacen a la progresión de la EAE en ratones adultos.

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Protocolo

1. Preparación de la ventana y la estructura de soporte

  1. Preparación de la ventana: prepare varias ventanas de varios tamaños (ancho = 1,8-2,2 mm; longitud = 4,5-5,2 mm) para la implantación.
    1. Haciendo la rebaba de taladro modificada para cortar el vidrio de la cubierta: usando una cantidad generosa de cemento dental, fije una rebaba de taladro a un eje (en nuestro caso, abrazaderas Bulldog viejas). Asegúrese de que la rebaba esté a ~45° en relación con el eje para facilitar su manejo.
      Nota: los escribas de diamante también funcionan bien para cortar vidrio de cubierta.
    2. Hacer la diapositiva A: con un portaobjetos de microscopio estándar, pegue con cinta adhesiva un trozo corto de papel de regla (~ 2 cm) en la parte inferior del portaobjetos para que pueda ver la regla a través del vidrio. A continuación, coloque un trozo de cinta adhesiva a lo largo del borde de la marca de 0 mm de la regla para que actúe como accesorio para el cubreobjetos en el siguiente paso.
    3. Utilizando la fresa de perforación modificada, el portaobjetos A y un portaobjetos de microscopio no modificado (portaobjetos-B), coloque un trozo de cubreobjetos (n.º 1,5 de grosor) hasta la marca de 0 mm en el portaobjetos-A. Use la corredera B para mantener la cubierta de vidrio en su lugar y como una plantilla para la línea de corte prevista. Corta el cubreobjetos en un rectángulo largo de aproximadamente 5 x 22 mm. Gire el vidrio cortado 90° y corte el rectángulo en un rectángulo más pequeño de ~2 x 5 mm.
  2. Modificaciones de grapas: se implantarán dos grapas modificadas para sostener y fijar la cámara de la ventana a las vértebras (ver sección 2.7-8).
    1. Con una grapa pequeña estándar (corona = 8 mm; pata = 4 mm), doble el centro de la corona ~ 90 ° para que las puntas de las patas casi se toquen.
    2. Dobla las puntas de las patas hacia afuera ~45° en el punto medio, de modo que la mitad distal de las patas quede paralela.
    3. Doble la mitad distal de las patas ~ 30 ° hacia arriba en relación con el plano de la grapa. Coloque las grapas modificadas en etanol antes de la cirugía para la esterilización.
      Nota: Las grapas también pueden esterilizarse con óxido de etileno o esterilizarse en autoclave.
  3. Modificaciones de clips: prepare un clip modificado para implantarlo como parte de la cámara (ver secciones 2.9-10) y para que actúe como clip de sujeción para la cirugía y las imágenes.
    1. Con un clip estándar de 25 mm, retira la pequeña curva dejando una forma de U alargada.
    2. Con unos alicates o destornilladores de agujas, reduzca el diámetro de la curva a ~2 mm manteniendo las puntas paralelas.
    3. Doble las puntas hacia afuera ~ 90 ° a unos 8-10 mm de la curva. Realice los ajustes necesarios para que quede plano.

2. Implantación de ventanas

Nota: Todos los procedimientos quirúrgicos y de cuidado animal se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas y fueron aprobados por el Comité Nacional de Estudios Animales de Francia (autorización n.º 13.300).

  1. Anestesiar al ratón (Ket/Xyl; dosis de inducción: 120 mg/kg, 12 mg/kg; dosis suplementaria, 40 mg/kg, 4 mg/kg), aplicar ungüento ocular en los ojos.
  2. Afeitar su espalda de aproximadamente ~2 cm de ancho por ~5 cm de largo, centrada en la joroba torácica, y limpiar la piel expuesta con jabón de yodo seguido de una solución de yodo. Limpie los guantes rociándolos con etanol al 90%.
  3. Con unas tijeras de tejido, corte la piel dorsal longitudinalmente sobre las vértebras T11 a L1 (~2 cm). Con un bisturí, realice incisiones longitudinales bilaterales entre las apófisis espinosas y transversales desde T11 hasta L1. Nota: Si los guantes o los instrumentos tocan el pelaje o la piel del animal, vuelva a limpiar los guantes o el instrumento con un esterilizador frío como etanol al 90% o Germ-X.
  4. Suspenda el ratón en la horquilla espinal estereotáxica: comience sujetando la horquilla espinal superior derecha en su posición. Agarre T11 con pinzas Adson y coloque la apófisis transversal T11 sobre la horquilla espinal fija. Mientras sostiene la vértebra en su lugar, sujete la horquilla espinal contralateral debajo de la apófisis transversa contralateral.
  5. Utilizando el mismo procedimiento que el paso 2.4, coloque L1 dentro de la horquilla espinal.
  6. Con un bisturí (n.º 23), raspe suavemente los músculos entre las apófisis espinosas y transversales de T11 a L1 para que las láminas sean claramente visibles. Para una mejor visión de los pedículos de T11, corte el tendón que se proyecta rostralmente desde la punta de la apófisis transversa.
  7. Enjuague las grapas modificadas con PBS e inserte las puntas de las grapas lateralmente a los pedículos vertebrales de T11 y L1 ajustando la distancia entre las puntas para que toquen ligeramente los pedículo>
  8. Pegue las grapas en su lugar con una pequeña gota de cianoacrilato en cada punto de inserción y retire el ratón de las horquillas del lomo.
  9. Aplique una capa delgada de cianocrilato en los bordes cortados de la piel y los músculos expuestos alrededor de las vértebras aclaradas, teniendo cuidado de no pegar las vértebras. Doble las puntas del clip modificado para que entren por debajo de las secciones que sobresalen de las grapas implantadas y descansen paralelas al eje largo de la columna vertebral aislada y salgan en esta posición.
  10. Comenzando en la interfaz piel-músculo, aplique varias capas de cemento dental para cubrir toda la abertura excepto las vértebras expuestas, asegurándose de implantar el clip de forma segura dentro del cemento dental.
  11. Una vez que el cemento dental esté curado (5-15 min), fije el mouse al 'soporte de clip' por la parte expuesta del clip implantado. Con fórceps, extirpe el músculo y otros tejidos blandos entre las apófisis espinosas y las láminas de las vértebras expuestas><. Nota: Cualquier dispositivo que pueda sujetar de forma segura la parte expuesta del clip sin causar tensión en el clip/cámara, y que pueda maniobrarse para reorientar el ratón durante la cirugía, puede utilizarse como "soporte de clip".
  12. Con el taladro de extracción de hueso, diluya las láminas de T12 y T13 bilateralmente. Para extirpar el hueso dorsal, agarre la apófisis espinosa con pinzas romas y levántelo teniendo cuidado de no aplicar fuerza hacia abajo hacia la médula espinal. Si el hueso no se desprende fácilmente, continúe adelgazando las láminas hasta que el proceso espinoso se pueda eliminar fácilmente.
  13. Con el taladro de extracción de hueso, continúe dando forma a los bordes laterales de las vértebras para formar una estructura de soporte para la ventana. Retire suavemente todos los fragmentos óseos pequeños que toquen la duramadre con pinzas romas. Asegúrese de mantener la humedad de la duramadre usando PBS.
  14. Elija una de las ventanas preparadas que sea un poco más ancha que la abertura de la laminectomía y pruebe qué tan bien descansa sobre el hueso expuesto. Lo ideal es que la ventana descanse bilateralmente sobre ambas vértebras de modo que el centro de la ventana toque la duramadre (Figura 1a). Sin embargo, la ventana no debe comprimir la médula espinal, incluso cuando se empuja la ventana hacia la médula espinal. Si la ventana está desequilibrada o descansa por encima de la duramadre, repita el paso 2.13.
  15. Una vez satisfecho con la laminectomía, coloque un pequeño trozo de papel de seda esterilizado en autoclave empapado en PBS sobre la médula espinal para evitar que se seque la duramadre y deje el ratón a un lado.
  16. Limpieza de la ventana: coloque la ventana en una solución de limpiador de ventanas durante varios segundos. Con un pedazo de papel de lente de microscopio, seque la ventana. Con el microscopio quirúrgico verifique que la ventana esté limpia y repita el proceso de limpieza si no es así. Coloque la ventana en un área limpia con fácil acceso para una rápida recuperación y colocación de la ventana en el paso 2.19.
  17. Recupere el mouse y retire el papel de seda. Retire suavemente cualquier residuo de la duramadre con pinzas romas y deje que la duramadre se seque hasta que esté ligeramente pegajosa.
  18. Llene rápidamente el tubo mezclador de silicona (Kwik-sil) y extruya la silicona en un portaobjetos limpio hasta que no salgan burbujas de la punta. Administre inmediatamente una pequeña gota de silicona a lo largo de la línea media de la médula espinal expuesta.
  19. Recupere las ventanas limpias con pinzas romas y colóquelas inmediatamente sobre la silicona. Con las pinzas romas, aplique una pequeña cantidad de presión a la ventana para esparcir la silicona a los bordes de la ventana y manténgala en su lugar durante ~ 1 min.
    Nota: Antes de mezclar, la silicona debe almacenarse por debajo de 27 °C, de lo contrario, el tiempo de curado puede aumentar significativamente y no se adherirá a la ventana o duramadre, lo que reducirá la claridad óptica.
  20. Libere lentamente la presión de la ventana. Si la ventana no se mueve, continúe inmediatamente con el paso 2.21. Sin embargo, si la ventana se eleva cuando se libera la presión (es decir, las vértebras se mueven), proceda al paso 2.21 mientras mantiene la presión sobre la ventana para mantenerla en su lugar.
  21. Aplicar cianoacrilato rostral y caudal de la ventana. Si el cianoacrilato no cubre los bordes rostral y caudal de la ventana, usa un palillo de dientes para guiar parte del cianoacrilato líquido sobre estos bordes. A continuación, guía el pegamento a lo largo de los bordes laterales de la ventana (Figura 1a) para cubrir todos los músculos circundantes. Nota: El cianoacrilato debe cubrir la superficie de los bordes exteriores de la ventana. Demasiado cianoacrilato puede comprometer la claridad óptica, si no hay suficiente cianocrilato, se formarán burbujas de aire entre la silicona y la ventana.
  22. Para proteger el cianoacrilato y aumentar la integridad estructural de la cámara, aplique cemento dental en todas las regiones cubiertas con cianoacrilato (Figura 1a). Al igual que con el cianoacrilato, comience en los bordes rostral y caudal y use un pequeño palo de madera para guiar el cemento dental a lo largo de los bordes de la ventana.

3. Cuidados postoperatorios, inducción de EAE y mantenimiento de ventanas

  1. Inyectar dexametasona (0,2 mg/kg) y Rimadyl (5 mg/kg) s.q. sobre las regiones pélvicas. Transfiera el ratón a una jaula tibia (~26 °C) con material de anidación. Los ratones deben ser completamente móviles, explorar su jaula y acicalarse después de que los efectos de la anestesia hayan disminuido por completo (generalmente 2-3 horas). Aloje a los animales individualmente y asegúrese de que tengan fácil acceso a la comida y al agua durante los primeros 1-2 días. Una vez que el ratón comience a recuperarse de la anestesia, inyecte buprenorfina (0,05 mg/kg) s.q. Después de la recuperación completa de la anestesia, el ratón no debería mostrar signos de dolor. Nota: Una vez que se ha recuperado completamente de la anestesia, cualquier signo de dolor o actividad motora anormal indica que la ventana no se implantó correctamente.
  2. Inyectar dexametasona (0,2 mg/kg) y Rimadyl (5 mg/kg) cada 2 días durante los primeros 10 días después de la cirugía (Figura 1a). Para inyectar ratones con ventanas, seda ligeramente al animal con isoflurano en una cámara de inducción (~1,75% de isoflurano en el aire durante 1-2 min). Retire el ratón de la cámara e inyecte inmediatamente las drogas. El ratón debe estar completamente despierto en <1 min.
    Nota: No frote el pescuezo de los ratones con ventanas implantadas, ya que esto puede causar la separación de la piel del implante. Es posible inyectar i.p. a ratones sin sedación permitiéndoles agarrar la tapa de una jaula con las patas delanteras y levantando suavemente las extremidades traseras. Sin embargo, en esta posición, el ratón a veces se alejará causando estrés a la ventana implantada. Esto puede provocar sangrado entre la ventana y la médula espinal, comprometiendo así la claridad óptica.
  3. La EAE puede ser inducida a las 2-3 semanas después del cese del tratamiento antiinflamatorio (~3-4 semanas después de la cirugía). Seda ligeramente el ratón como se describe en el paso 3.2. Retirar el ratón de la cámara de inducción y mantener la sedación con una mascarilla de isoflurano colocada sobre la nariz.
  4. Inyecte el péptido MOG35-55 (75 μg en el adyuvante de Freund que contiene 800 μg de mycobacterium tuberculosis) en 3 ubicaciones s.q. diferentes (bilateralmente sobre el fémur y en la base de la cola) y la toxina de tos ferina (400 ng) i.p.14,15
    Nota: Los ratones con EAE requieren cuidados complementarios en comparación con los ratones con ventanas solamente. Pesa a los ratones EAE todos los días y asegúrate de que tienen fácil acceso a la comida y al agua en todo momento. Complementar con un 3% de gelatina de agarosa que contiene para mantener la hidratación y el peso de los animales. La glucosa (1-3%) también se puede agregar a la gelatina para obtener calorías adicionales.
  5. Dos días después de la inducción de EAE, repita el protocolo de sedación descrito en el paso 3.2 e inyecte una segunda dosis de toxina pertussis (400 ng) I.P.
  6. Para obtener imágenes de la médula espinal, primero sedar al animal como se describe en el paso 3.2 y anestesiar ligeramente con ketamina/xilacina (100 mg/kg; 10 mg/kg) i.p. Esto proporcionará ~ 1 hora de imágenes.
  7. Para sesiones de imagen que duran <2 horas, se puede mantener una anestesia ligera con inyecciones suplementarias de ketamina/xilacina (50 mg/kg; 5 mg/kg) cada 45-60 min. Alternativamente, para sesiones de imagen más largas, los ratones pueden ser sedados continuamente con isoflurano (0,75-1,25% de isoflurano en aire humidificado)
    Nota: las ventanas se pueden limpiar con un microscopio quirúrgico limpiando suavemente los residuos con la esquina de un pañuelo de papel o un hisopo con punta de algodón. No use alcohol para limpiar la ventana porque puede degradar algunos tipos de cemento dental y puede enfriar la médula espinal.
  8. Una vez ligeramente anestesiado, el ratón se fija firmemente a un soporte de clip por la parte expuesta del clip implantado (Figura 1b).
  9. La médula espinal se alinea perpendicularmente a la lente del objetivo ajustando la posición del clip dentro del soporte, ajustando la posición del soporte y ajustando la posición de la platina. La superficie dorsal de la médula espinal se obtiene rápidamente y la vasculatura dorsal se utiliza para determinar la orientación de la médula espinal.

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Resultados

El uso de ventanas de vidrio implantadas crónicamente en combinación con microscopía intravital de dos fotones y modelos de EAE podría ser una herramienta útil para comprender los mecanismos celulares que subyacen a la patología de las enfermedades autoinmunes desmielinizantes. Mediante nuestro método de implantación, descubrimos que la mayoría de las ventanas estaban claras al momento de la inducción de EAE y permanecieron claras durante toda la progresión de la enfermedad (Figura 1c). Con este enfoque,...

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Discusión

Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre las médulas espinales expuestas de ratones adultos para estudiar la progresión dinámica de EAE a lo largo del tiempo. Se ha utilizado un enfoque similar de implantación de ventanas de vidrio para estudiar modelos de lesión de la médula espinal13 y también puede ser útil para estudiar otras patologías de la médula espinal como glioblastomas, meningitis o la fisiología celular de la médula espinal normal. Para nuestro método, la estabilizac...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos a C. Ricard, M-C. Amoureux, A. Jaouen y S. Meijia-Gervacio por sus útiles debates; M. Hocine y C. Meunier, y al personal de las instalaciones de imágenes de animales y PicSIL del IBDML para el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por una subvención institucional del Centre National de la Recherche Scientifique, y por subvenciones de la Association de Recherche sur la Sclérose en Plaque (ARSEP) (a G.R. y K.K.F), Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC), Fédération de Recherche sur le Cerveau (FRC) Institut de Recherche sur la Moelle Epinière (IRME) (a FD). K.K.F. contó con el apoyo de una beca de la ARSEP. Las imágenes se realizaron en el centro de imágenes PIcSIL del IBDML.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Taladro de extracción de huesoWorld Precision InstrumentsIDEAL MICRO-DRILLTambién vendido por Harvard Apparatus.
Cualquier taladro de hueso quirúrgico de alta calidad será suficiente.
Fresa de perforación (# 1/4 o 1/2 fresa redonda de carburo)World Precision Instruments501860 (#1/4)
501860 (#1/2)		También vendido por Harvard Apparatus
StaplesLyreco5.002.567Corona = 8 mm
Pata = 4 mm
ClipCualquier clip estándar de 25 mm
Destornilladores de agujasFine Science Tools12003-15
Tijeras depapelHerramientas de ciencia fina14028-10
Pinza AdsonHerramientas de ciencia fina11027-121 x 2 dientes
Pinzas romasHerramientas de ciencia fina11293-00
Horquillas espinalesAparato Harvard724813
Cemento dentalGACD12-565 & 12-568
Elastómero de siliconaWorld Precision InstrumentsKWIK-SILTambién disponible a través de Coherent Scientific y Fisher Scientific
CianoacrilatoEleco-EFDCyanolit 201
MicroscopioZeiss7MPNuestro microscopio está en configuración vertical y está equipado con 5 detectores NDD.
ObjetivoZeissW Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm Distancia detrabajo = 1,8 mm

Referencias

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