Unión covalente de BMP-2 en las superficies utilizando una monocapa enfoque de auto-ensamblada

Resumen

Se describe un método para llevar a cabo la inmovilización eficaz de BMP-2 en las superficies. Nuestro enfoque se basa en la formación de una capa monomolecular auto-ensamblada para lograr la unión de BMP-2 a través de sus residuos de amina libres covalente. Este método es una herramienta útil para el estudio de señalización en la membrana celular.

Resumen

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un factor de crecimiento embebido en la matriz extracelular del tejido óseo. BMP-2 actúa como desencadenante de la diferenciación de células mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la cicatrización y la formación de hueso novo. El uso clínico de la humana recombinante BMP-2 (rhBMP-2), en relación con los andamios ha suscitado controversias recientes, en base a la forma de presentación y la cantidad que se va a entregar. El protocolo presentado aquí proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 para los estudios in vitro sobre las células. Describimos cómo formar una monocapa auto-ensamblado que consiste en un engarce heterobifuncional, y mostramos el paso de unión posterior para obtener la inmovilización covalente de rhBMP-2. Con este enfoque es posible lograr una presentación sostenida de BMP-2, mientras que el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína. De hecho, la inmovilización de superficie de BMP-2 permite que las investigaciones dirigidas por la prevención de anuncios inespecíficosdesorción, mientras que la reducción de la cantidad de factor de crecimiento y, más notablemente, lo que dificulta la liberación no controlada de la superficie. Ambos eventos de señalización de corto y largo plazo provocados por BMP-2 se llevan a cabo cuando las células están expuestas a las superficies que presentan inmovilizado covalentemente rhBMP-2, por lo que este enfoque adecuado para los estudios in vitro sobre las respuestas celulares a BMP-2 estimulación.

Introducción

Proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2) es un miembro del factor de crecimiento transformante (TGF-β) de la familia y actúa como inductor de la formación de novo de hueso, así como regulador de varios tejidos durante el desarrollo embrionario y adulto homeostasis ^1-3. Cada monómero de la proteína biológicamente activa homodimérica BMP-2 contiene un motivo de "nudo de cisteína", que está altamente conservada en todas las BMP ^4. Seis de los siete residuos de cisteína forman enlaces disulfuro intramoleculares que estabilizan cada monómero, mientras que la séptima cisteína está involucrado en la dimerización, formando un enlace intermolecular entre los dos monómeros ^5,6. Este nudo de cisteína altamente conservados define la estructura tridimensional de la proteína BMP-2 y determina sus propiedades únicas, tales como resistencia al calor, desnaturalizantes y ácida de pH ^7-9. BMP-2 se une a receptores transmembrana quinasa serina / treonina, induciendo de este modo la transducción de señales ^{10-12. Dependiendo del modo de oligomerización del receptor, diferentes vías de señalización se activan: una cascada de señalización Smad-independiente conduce a la inducción de la fosfatasa alcalina a través de señalización de p38, mientras que una vía de Smad-dependiente activado por resultados de fosforilación del receptor de Smad en la translocación nuclear complejo y la activación de la transcripción de genes diana específicos, tales como el inhibidor de la diferenciación (Id) 12-14.}

En el hueso, BMP-2 induce la diferenciación de células madre mesenquimales en osteoblastos, estimulando así la curación y la formación de novo de hueso. Actualmente, expresada de forma recombinante BMP-2 se aplica clínicamente para mejorar la curación de los sitios fracturados. Una estrategia común en ingeniería de tejido óseo es el uso de factores de crecimiento inyectables, que es menos invasiva en comparación con los sistemas de suministro locales. Sin embargo, estudios in vivo y aplicaciones clínicas han demostrado que la vida media biológica corta, loc inespecíficazación y rápida de domiciliación de BMP-2 puede dar lugar a varios problemas locales, ectópicos y sistémicos ^15. Por lo tanto, para obtener una presentación eficaz, el atrapamiento o la inmovilización de la BMP-2 dentro o sobre materiales es necesario para su entrega local y sostenida en el sitio diana. La liberación sostenida se puede lograr con los enfoques de retención no covalentes, tales como atrapamiento físico, adsorción o de iones complejación ^16. Sin embargo, se sabe que la adsorción no específica de proteínas a superficies puede resultados en la desnaturalización de las moléculas ^17. Para la unión de factores de crecimiento covalente, diferentes tipos de soportes se han desarrollado en la última década. El uso de moléculas de unión bifuncional que se dirigen a grupos amino o carboxilo de la proteína, por ejemplo, es un tipo de enfoque que no requiere necesariamente la modificación de proteínas para lograr su inmovilización. De hecho, mientras que la modificación de proteínas ofrece la ventaja de controlar la orientación de proteína,la introducción de dominios artificiales, etiquetas de péptidos y cadenas específicas de sitio puede alterar la actividad biológica de factores de crecimiento ^17. Por lo tanto, para eludir la desnaturalización debida a la interacción con el material de apoyo, las superficies se pueden funcionalizar de antemano, por ejemplo, con una capa monomolecular auto-ensamblada (SAM) de una molécula de unión, seguido por acoplamiento del factor deseado ^18. Hemos utilizado un enfoque basado en el SAM para inmovilizar covalentemente BMP-2 en una superficie por la orientación de sus residuos amino libres y hemos demostrado que la proteína inmovilizada conserva tanto su actividad biológica a corto y largo plazo ^19. Este protocolo proporciona una forma simple y eficiente para entregar BMP-2 a las células para estudios in vitro de los mecanismos que se producen en la membrana celular y regulan la señalización intracelular responsable de la señalización de osteogénico.

Protocolo

1. Síntesis de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxisuccinimida éster (MU-NHS)

1. Añadir gota a gota una solución de 500 mg de N-hidroxisuccinimida y 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina en 10 ml de acetona (PA) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanoico en 40 ml de diclorometano (PA) a temperatura ambiente (RT).
2. Enfriar la reacción a 0 ° C y añadir gota a gota 1,1 g de N, N '-diciclohexilcarbodiimida en 10 ml de diclorometano (bajo atmósfera de nitrógeno). Mantener la reacción a baja temperatura durante 1 hora y después se agita a TA durante la noche.
3. Se filtra el precipitado y se seca a presión reducida. El producto se purifica mediante cromatografía flash con benceno petróleo y acetato de etilo (pa) en una proporción de 1:1.

2. Preparación de capas de oro homogéneos

1. Cubreobjetos de vidrio limpias con toallitas de precisión y sonicar ellos durante 5 minutos en una solución que contiene una mezcla 1:1 de acetato de etilo (pa) y metanol (pa). Rinse sustratos con metanol y se secan bajo flujo de nitrógeno.
2. Coloca los sustratos limpios en el dispositivo de revestimiento por bombardeo iónico. Evacuar la cámara. Retire la capa de óxido de cromo superior de la meta de cromo mediante pulverización durante 60 segundos. Colocar las muestras por debajo de la viga de metal y recubrirlos con una capa de cromo de 10 nm, seguido por recubrimiento con una capa de oro de 40 nm.

3. Inmovilización de la superficie de la BMP-2

1. Disolver MU-NHS en N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentración final de aproximadamente 1 mM y se incuba sustratos de oro en la solución MU-NHS a TA durante 4 h bajo atmósfera de nitrógeno.
2. Superficies Someter a ultrasonidos en DMF durante 2 min, enjuague con DMF y MeOH y se secan bajo flujo de nitrógeno.
3. Preparar una solución madre de rhBMP-2 en HCl 4 mM estéril con una concentración de 100 g / ml (almacenar alícuotas a -80 ° C). Para diluciones de trabajo (3,5 mg / ml), se diluye la solución madre en PBS / NaCl (PBS que contenía 1 M de NaCl) y unJUSTE a pH 8,5 inmediatamente antes del uso.
4. Incubar superficies funcionalizadas MU-NHS en la solución de trabajo de rhBMP-2 a 4 ° C durante la noche. Aspirar el sobrenadante de la incubación. Superficies Sonicar en PBS / NaCl durante 2 minutos y se lavan 3 veces con PBS estéril / NaCl.

4. Caracterización de superficies

1. Para bloquear la adsorción no específica del anticuerpo, se incuban las superficies con un 5% de BSA (w / v) en solución de PBS durante 1 hora a TA, seguido de incubación con un anticuerpo anti-BMP-2 (1:100 en 1% (w / v ) solución de BSA / PBS) durante 1 hora a TA. Lave las superficies dos veces con PBS y déjelos en remojo durante 30 seg.
2. Incubar sustratos con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:1000 en 1% (w / v) de solución de BSA / PBS) durante 30 min a TA, a continuación, lavar dos veces con PBS.
3. Utilice ensayo de rojo Ampliflu para medir la actividad enzimática de HRP a 570 nm con un lector de placas.

5. Análisis de la Actividad Biológica

1. Seed 1 x 10 ⁵ ratón mioblastos C2C12 por pocillo en 6 pocillos plAtes en medio de crecimiento, que consisten en un DMEM de alta glucosa que contenía piruvato suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina y se incuba durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Morir de hambre las células en DMEM libre de suero durante 3-5 horas antes de la siembra en las superficies decoradas con inmovilizada BMP-2.
3. Para la investigación de la inducción de la señalización de corto plazo, sustituir el medio por 200 l DMEM libre de suero y colocar los inmovilizados BMP-2 superficies superiores a las células. La superficie debe ser manejado con pinzas de punta fina para evitar que se raye.
4. Retire suavemente las superficies y aspirar el medio con una pipeta, se lavan las células dos veces con PBS. Continúe con el análisis de las respuestas de células.
5. Para el análisis de la actividad biológica a largo plazo, células de la placa en las superficies y la cultura ellos a 37 ° C / 5% de CO ₂ en condiciones de suero bajas (2% de FBS) durante seis días.

Resultados

En nuestra configuración, el oro fue elegido como excipiente, ya que proporciona un sistema biológico no específico pero químicamente sintonizable. Además, la aplicación de las monocapas de autoensamblaje implica muchos beneficios: SAM adsorber de forma espontánea a través de sus "cabeza-grupos" en metales y forman monocapas con pocos defectos, mientras que sus grupos terminales funcionales se pueden modificar adicionalmente. Por tanto, proporcionan una plataforma para adaptar las propiedades de la interfaz de una maner...

Discusión

En este protocolo se describe la preparación de superficies funcionalizadas con rhBMP-2 bioactivo. Este enfoque comprende dos etapas: 1) la formación inicial de una monocapa auto-montaje (SAM) de un conector bifuncional en la superficie de oro, 2) la inmovilización covalente de la proteína rhBMP-2. En trabajos anteriores, hemos validado la unión efectiva del enlazador bifuncional y el factor de crecimiento, y demostramos que superficie inmovilizada rhBMP-2 mantiene su actividad biológica ^19. La bioactividad d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
N-hidroxisuccinimida	Sigma-Aldrich	130672
4-(dimetilamino)piridina	Sigma-Aldrich	522805
Aplicación de acetona		A2282
Ácido 11-mercaptoundecanoico	Sigma-Aldrich	674427
Diclormetano	Merck	106050
N,N'-diciclohexisilcarbodiimida	Sigma-Aldrich	D80002
Benceno de petróleo	Merck
Cubreobjetos de vidrio	Carl Roth	M 875
Aplicación de acetato de etiloChem		A3550
Metanol	Carl Roth	4627
N,N-dimetilformamida	Carl Roth	T921
rhBMP-2	R& D Systems	355-BM	Libre de portadoras; expresado en E.coli
PBS	PAA	H15-002
NaCl	Carl Roth	HN00.2
Poli(dimetilsiloxano) (PDMS)	Dow Corning
Kit de elastómero de silicona Sylgard 184	Dow Corning
Anti-rhBMP-2	Sigma	B9553
Cabra anti-ratón IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005	Anticuerpo secundario
Ampliflu Red ensayo	Sigma	90101
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), líquido	Gibco	41966
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma	F7524	Estéril filtrado, probado en cultivo celular
Pen/Strep	Gibco	15140
Tripsina 0.05% (1x) con EDTA 4Na	Gibco	25300
Glicina (0.1 M)	Riedel-de Haë n	33226
IGEPAL CA-630 (1%)	Sigma	I8896	Tampón de lisis (ensayo ALP)19
Cloruro de magnesio (MgCl2)(1 mM)	Carl Roth	HNO3.2
Cloruro de zinc (ZnCl2) (1 mM)	Carl Roth	3533.1
p-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	S0942	Sustrato de fosfatasa
Cadena pesada anti-misina (MHC)	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas, Universidad de Iowa	MF20	Anticuerpo monoclonal
Alexa Fluor 488 Cabra anti-ratón	IgG Invitrogen	A11001
DAPI	Sigma	D9542
Equipo
Baño Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Frecuencia 35 kHz	BANDELIN electronic GmbH Co. KG
MED 020 Sistema de recubrimiento por pulverización catódica	BAL-TEC AG		Condiciones de recubrimiento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 seg Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 seg
Tecan Infinite M200 Lector de placas	Tecan