Enriquecimiento Y Purga De Células Madre Embrionarias Humanas Por La Detección De Antígenos De Superficie Celular Utilizando Los Anticuerpos Monoclonales TG30 Y GCTM-2

Resumen

Se describe el uso de los anticuerpos monoclonales TG30 (CD9) y GCTM-2 para la detección combinada de antígenos de la superficie celular a través de la fluorescencia activada por la clasificación celular (FACS) para la identificación y enriquecimiento de células madre embrionarias humanas vivas (hESC) utilizando la selección positiva y también el uso de la selección negativa para purgar hESCs de una población de células mixtas.

Resumen

Las células madre embrionarias humanas (hESC) pueden autorrenovándose indefinidamente in vitro,y con las señales apropiadas se pueden inducir a diferenciarse en potencialmente todos los linajes celulares somáticos. Los derivados diferenciados del hESC se pueden potencialmente utilizar en terapias del trasplante para tratar una variedad de enfermedades célula-degenerativas. Sin embargo, los protocolos de diferenciación de hESC generalmente producen una mezcla de tipos diferenciados de células diana y fuera del objetivo, así como células indiferenciadas residuales. Para la traducción de hESC-derivados diferenciados del laboratorio a la clínica, es importante poder discriminar entre células indiferenciadas (pluripotentes) y diferenciadas, y generar métodos para separar estas poblaciones. La aplicación segura de los tipos de células somáticas derivadas de hESC solo se puede lograr con poblaciones libres de células madre pluripotentes, ya que las hESCs residuales podrían inducir tumores conocidos como teratomas después del trasplante. Con este fin, aquí se describe una metodología para detectar antígenos de superficie celular asociados a pluripotencia con los anticuerpos monoclonales TG30 (CD9) y GCTM-2 a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para la identificación de pluripotentes TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs utilizando la selección positiva. Utilizando la selección negativa con nuestra metodología TG30/GCTM-2 FACS, pudimos detectar y purgar hESCs indiferenciados en poblaciones sometidas a una diferenciación en etapa muy temprana (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). En un estudio adicional, muestras libres de células madre pluripotentes de células TG30^Neg-GCTM-2^Neg diferenciadas seleccionadas utilizando nuestro protocolo TG30/GCTM-2 FACS no formaron teratomas una vez trasplantados a ratones inmuno-comprometidos, apoyando la robustez de nuestro protocolo. Por otro lado, TG30/GCTM-2 FACS mediada por el passaging consecutivo de TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs enriquecidos no afectó a su capacidad de auto-renovarse in vitro o su pluripotencia intrínseca. Por lo tanto, las características de nuestra metodología TG30/GCTM-2 FACS proporcionan un ensayo sensible para obtener poblaciones altamente enriquecidas de hPSC como insumos para ensayos de diferenciación y para eliminar hESC potencialmente tumorigenic (o residual) de las poblaciones de células derivadas.

Introducción

Hpsc (hPSC) incluyen células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC). HPSC puede autorrenovándose indefinidamente en condiciones de cultivo adecuadas sin perder su capacidad conocida como "pluripotencia". La pluripotencia se define como el potencial de una célula para diferenciarse en esencialmente cualquier linaje celular somático, incluidas las células representativas de cada una de las tres capas de células germinales embrionarias. El notable potencial de hPSC proporciona un medio para una gran variedad de aplicaciones basadas en células, incluidas las opciones terapéuticas. Por ejemplo, hay trastornos que involucran la muerte celular y la degeneración, donde la funcionalidad normal de las células en el cuerpo humano se ve comprometida, como en la insuficiencia cardíaca, las lesiones de la columna vertebral, la diabetes, la enfermedad de Parkinson, algunos cánceres y otras patologías clínicas. Los pacientes que sufren estas condiciones podrían ser tratados potencialmente trasplantando células somáticas sanas y funcionales que se han derivado de hPSC en el laboratorio. Sin embargo, los protocolos actuales de diferenciación de hPSC no son 100% eficientes y producen una mezcla de tipos diferenciados de células diana y fuera del objetivo, así como hPSCs residuales que no han sufrido diferenciación, en lugar de continuar auto-renovando^1-3. La presencia de incluso un pequeño número de hPSC en una muestra de células somáticas derivadas de hPSC destinadas a trasplante en pacientes constituye un riesgo clínico grave, ya que estas células, por su naturaleza inherente a formar tejidos de las tres capas germinales embrionarias, podrían potencialmente formar in vivo un tipo de tumor conocido como teratoma. Por lo tanto, solo las poblaciones de células diana que se determine que están libres de células madre pluripotentes pueden considerarse seguras para el trasplante en pacientes. Hay varios enfoques reportados para lograr potencialmente la purga de hPSCs residuales después de la diferenciación, (para su revisión ver Polanco y Laslett⁴). Hemos divulgado previamente el uso de los anticuerpos monoclonales TG30 (CD9) y GCTM-2 juntados a la clasificación activada fluorescencia de la célula (FACS) para identificar las células madres pluripotentes y discriminarlas de las células que experimentan el primero tiempo de la diferenciación en culturas de las líneas^5-7del hESC.

Una ventaja de usar anticuerpos para detectar antígenos de la superficie celular es que las células diana suelen ser viables después de la unión y/o etiquetado de anticuerpos. Por lo tanto, las células diana se pueden recolectar después del etiquetado de anticuerpos y reculturarlas para su expansión y otras aplicaciones antes del trasplante. Una advertencia para los antígenos de la superficie celular expresados en hPSC es que no son exclusivos de la etapa pluripotente y en muchos casos se vuelven a expresar temporalmente durante el desarrollo y, por lo tanto, se detectarán en algunos tipos de células diferenciadas. Por lo tanto, si el objetivo es utilizar anticuerpos para detectar células pluripotentes humanas y purgarlas de una muestra de células derivadas de hPSC, los anticuerpos seleccionados no deben reaccionar también con antígenos en los tipos de células diferenciadas específicas destinadas al trasplante. Desafortunadamente, hay un número limitado de anticuerpos que detectan marcadores de la superficie celular en hPSCs ⁴vivos, lo que limita las opciones de selección. Además, algunos estudios han señalado que la detección de un marcador de superficie unicelular no es suficiente para eliminar todos los hPSC, lo que sugiere que cualquier intento de eliminar todas las subpoblaciones pluripotentes de hPSC debe basarse en métodos que utilicen dos o más anticuerpos que detecten diferentes epítopos expresados por hPSCs ^9-10. Como se mencionó anteriormente, solo las células derivadas de hPSC que podrían determinarse como poblaciones de células libres de células madre pluripotentes son apropiadas para el trasplante humano. Alcanzar este nivel de rigurosidad puede no lograrse con un solo paso a través de una tecnología de clasificación celular mediada por anticuerpos. La recultura de la población enriquecida de células diana diferenciadas y las rondas subsiguientes de clasificación celular pueden ser necesarias para obtener definitivamente muestras libres de células madre pluripotentes.

En nuestro laboratorio, hemos caracterizado extensivamente dos anticuerpos de la célula-superficie del hES, TG30 (CD9) y GCTM-2, para la detección de células pluripotentes vivas. Nuestros estudios han demostrado que la detección combinada de TG30 y GCTM-2 se correlaciona fuertemente con la expresión de genes canónicos asociados a la pluripotencia en las líneas ^{hESC 5-7.} El immunoprofiling de TG30/GCTM-2 FACS ha mostrado constantemente que las culturas del hESC constituyen un gradiente continuo cuantitativo de la expresión ^5-7TG30/GCTM-2. Hemos establecido arbitrariamente cuatro poblaciones (P) de células dentro de este gradiente TG30/GCTM-2: P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^{Mid-GCTM-2Mid)}y P7 (TG30^{Hi-GCTM-2Hi) 5-7.} Nuestra caracterización de estas poblaciones de células P4, P5, P6 y P7 ha demostrado que las subfracciones P6 y P7 expresan un gran número de genes asociados a la pluripotencia y forman eficientemente colonias similares a tallos cuando se reculban post-FACS ^2-3. Por otro lado, las células P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg)expresan un gran número de marcadores de diferenciación y constituyen los tipos celulares espontáneamente diferenciados que ocurren típicamente en cultivos en expansión de las líneas hESC ^5-6. Decidimos probar la potencialidad de nuestro TG30/GCTM-2 FACS para la eliminación selectiva de hPSCs residuales después de la diferenciación de la etapa temprana, y también para el enriquecimiento de las poblaciones pluripotentes de la célula madre. El protocolo descrito a continuación muestra cómo recolectar y reculturar células P4 diferenciadas (TG30 Neg-GCTM-2^Neg)post-FACS para lograr la purga de P7 pluripotente (TG30^{Hi-GCTM-2Hi).} Además, también explicamos la recolección y recultura de célulaspluripotentes P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)para obtener un cultivo enriquecido de células pluripotentes, que posteriormente podría ser utilizado como una población de entrada definida para aumentar potencialmente la eficiencia y consistencia de los ensayos de diferenciación.

Protocolo

El siguiente protocolo se realizó utilizando cultivos a granel estándar hESC-MEL1¹¹ proporcionados por las instalaciones de StemCore en la Universidad de Monash (Melbourne). Esta línea celular se cultiva rutinariamente en una capa de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados mitóticamente (MEF) en bFGF complementado con medios hESC/KOSR⁷ y se mantiene con disociación enzimática (colagenasa) cada 5-7 días^8. Los cultivos de hESC cultivados hasta ~80% de confluencia en matraces de 75 cm² (T75) se utilizan como poblaciones de entrada para este protocolo. Todos los procedimientos de manipulación celular descritos a continuación deben realizarse en condiciones asépticas en un gabinete de bioseguridad de clase II filtrado por HEPA.

Dos días antes de realizar un ensayo de FACS TG30/GCTM-2, prepare las placas de cultivo T75 (descritas en la sección 1) que se utilizarán para el recultivo de células recuperadas después del FACS (descritas en la sección 4).

1. Siembra de MEF y preparación de medio condicionado por MEF

1.1 DÍA -2: Chapado de MEF en matraces T75

1. Pipetear 10 ml de gelatina al 0,1% p/v en cada matraz T75 e inclinar la superficie de la capa uniformemente.
2. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en un armario de bioseguridad.
3. Aspirar la solución de gelatina.
4. Añadir 20 ml de MEF-medio al matraz y preequilibrar a 37 °C/5% de CO₂ durante 30 min en una incubadora de cultivos celulares.
5. Placa de mef inactivada mitóticamente en matraz(s) preparado(s) en las siguientes densidades. Para 1/3 MEF densidad semilla 1.4 x 10⁴ células/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEF). Para la semilla mef de densidad completa 5,3 x 10⁴ células/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEF).

Nota: Utilizamos rutinario mefs que mitotically fueron desactivados por la γ-irradiación. En Michalska¹²se puede encontrar un protocolo para la preparación de MEF irradiados con γ.

6. Incubar cultivos de MEF irradiados a 37 °C/5% de CO₂ durante la noche. Los matraces de 1/3 se pueden incubar durante 1-4 días sin cambio de medio MEF. Estos matraces se utilizan para el replating de las células post-FACS (como en el protocolo 4). Los matraces mef completos se incuban durante la noche para generar CM como se indica a continuación en el paso 1.2.

1.2 DÍA -1: Preparación del medio condicionado por MEF (CM)

1. Aspirar mef-medio a partir de matraces MEF T75 completos.
2. Añadir 25 ml de medio hESC/KOSR preequilibrado suplementado con 5 ng/ml de FGF-2 humano por matraz T75. Incubar a 37 °C/5% de_CO2 durante 24 horas.
3. Recoja el medio condicionado por MEF (CM) en un tubo de cultivo de tejido estéril, complemente recientemente el CM con 10 ng/ml de FGF-2 humano y filtre usando un filtro de poliéteresulfona de 0,22 μm.
4. Para producir CM adicional, repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3 diariamente en la misma cultura MEF durante una semana.

El día de la realización de un ensayo TG30/GCTM-2, reemplace el medio MEF en frascos T75 de 1/3 MEF con CM y preequilibrar durante al menos 30 minutos antes de sembrar cualquier hESCs o células derivadas de hESC recuperadas del procedimiento como se describe a continuación. El CM se usa fresco o se almacena a 4 °C durante un hasta 2 semanas. El CM se utiliza en este protocolo ya que en nuestras manos aumenta la viabilidad de las células post-FACS en comparación con los medios no acondicionados (resultados no mostrados).

2. Realización de un ensayo TG30/GCTM-2 FACS: Disociación de cultivos a granel de hESC en células individuales

Nota: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medio a 4 °C.

1. Aspirar el soporte hESC/KOSR a partir de dos matraces T75 con una línea hESC cultivada.
2. Enjuague las células en cada T75 con 10 ml de DPBS y aspire para eliminar.
3. Añadir 3 ml de solución de disociación TrypLE Express en cada matraz T75. Incubar a 37 °C/5% de_CO2 durante 5 min.
4. Golpee el lado de los frascos para obtener el despreocupamiento completo de las células. Comprobar bajo el microscopio. Si las células no se desalojan fácilmente, incubar durante otros 2-3 min a 37 °C/5% de_CO2.
5. Añadir 10 ml al 20% de FBS/DMEM-F12 (mantenido a 4 °C) a cada matraz T75. Utilizando una pipeta estéril de 10 ml triturar suavemente las células disociadas varias veces contra la pared del matraz para lograr una suspensión predominantemente unicelular.
6. Coloque un colador celular de 70 μm en un tubo estéril de polipropileno de 50 ml. Utilice una pipeta estéril de 10 ml para forzar las suspensiones unicelulares hESC agrupadas de los dos matraces T75 a través del colador.
7. Deseche el colador de células, reemplace la tapa del tubo y centrífuga la suspensión hESC agrupada a 1.000 x g durante 2 min.
8. Deseche el sobrenadante y lave las células reutilizando suavemente el pellet en 10 ml al 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C).
9. Realizar una segunda centrifugación a 1.000 x g durante 2 min.
10. Deseche el sobrenadante, agregue 10 ml al 20% de FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C) y triturar suavemente para resuspend las células. Coloque el tubo de 50 ml sobre hielo. Este tubo se utilizará para el procedimiento de inmunotentenimiento sort sample que se describe a continuación.
11. Tome 20 μl de la suspensión unicelular hESC (paso 2.10) para el conteo de números de células usando un hemotocitómetro. Usted debe esperar un rendimiento de 10-15 millones de células por matraz T75.

Nota: FBS se utiliza en esta parte del protocolo para aumentar la viabilidad de la célula poste-FACS.

3. Tinción inmunofluorescente de los antígenos de superficie celular TG30 y GCTM-2

1. Alícuota 150 μl (~100.000 células) de una suspensión unicelular hESC (a partir del paso 2.11) en cada uno de los seis tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Estas seis alícuotas se utilizarán para los controles de tinción necesarios para calibrar el ensayo en la máquina FACS. La suspensión celular restante de ~9 ml será su Sort Sample en la que el cultivo disociado será costained para la detección de TG30 y GCTM-2, de acuerdo con las Tablas 1 y 2.
2. Realizar reacciones de unión de anticuerpos primarios en 20% FBS/DMEM-F12. Los volúmenes de reacción final deben ser de ~9 ml para la muestra de clasificación y de 200 μl para los controles. Incluya controles de isotipo como anticuerpos primarios. Coloque los tubos horizontalmente sobre hielo y mezcle suavemente durante 30 minutos en una plataforma oscilante.
3. Reacciones primarias del anticuerpo de la centrífuga en 1.000 x g por 2 minutos.
4. Deseche el sobrenadante y lave las células reenviando el pellet en 20 ml al 20% FBS/DMEM-F12 (precalcinado a 4 °C) para la muestra de clasificación y 200 μl para los controles.
5. Realice un segundo giro a 1.000 x g durante 2 min.
6. Realizar reacciones de unión de anticuerpos secundarios en FBS/DMEM-F12 al 20%. Los volúmenes de reacción final deben ser de 2,5 ml para la muestra de clasificación y de 200 μl para los controles. Prepare el tubo de reacción PE-anti-ratón CD90.2 en esta etapa. Coloque los tubos horizontalmente sobre hielo y mezcle suavemente durante 30 minutos en una plataforma oscilante.

Nota: Durante este tiempo de incubación, es conveniente recoger CM y preparar matraces T75 de 1/3 DE MEF con CM como en el punto 1.2.

7. Reacciones secundarias del anticuerpo de la centrífuga en 1.000 x g por 2 minutos.
8. Deseche el sobrenadante y lave las células DOS VECES reensamblando el pellet en 20 ml al 20% FBS/DMEM-F12 (precalcinado a 4 °C) para la muestra de clasificación y 200 μl para los controles.
9. Realice un giro a 1.000 x g durante 2 minutos después de cada lavado y coloque tubos en hielo.
10. Deseche los sobrenadantes y los pellets de células resuspentes en FBS/DMEM-F12 al 20% suplementados con yoduro de propidio (PI) a 0,3 μg/ml. Utilice 2-3 ml para la muestra de clasificación y 300 μl para los controles.

Nota: NO agregue PI al tubo de control con células no manchadas.

11. Utilice una micropipeta P1000 para forzar la suspensión de cada célula individual a través de un colador de células de tapa de 35 μm, acoplado a tubos de ensayo redondos de poliestireno de tubo de 5 ml.
12. Centrífuga a 50 g/min para forzar la suspensión de celda residual en las tapas del colador.
13. Resuspend cada suspensión de una sola célula tocando los lados de los tubos, y colocar sobre hielo. Sus células ahora están listas para FACS. Por favor, proceda de inmediato.

4. Cultivo Post-FACS de Células de Subfracción TG30/GCTM-2 en Frascos de 75 cm² (T75)

1. Hemos informado previamente cómo configurar una máquina FACS para inmunoprofilado TG30/GCTM-2^7. El procedimiento permite la recuperación de hESCs individuales viables, libres de MEFs, y dentro de las puertas de P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^{Mid-GCTM-2Mid)}y P7 (TG30^Hi-GCTM-2Hi)- ver Figura 1E. Configure la máquina FACS para TG30/GCTM-2 FACS como en nuestro informe anterior para recuperar las subfracciones celulares que se utilizarán a continuación.
2. Añadir 1 ml cm, preparado como en el paso 1.2, a cada uno de los dos tubos de ensayo redondos de poliestireno de 5 ml antes de recoger las células de la máquina facs. Colocar sobre hielo.
3. Recuperar 400.000 células cada una de lassubfracciones de células diferenciadas P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg)y pluripotentes P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)utilizando TG30/GCTM-2 FACS.
4. Centrifugar los tubos de recolección a 1.000 x g durante 5 min.
5. Aspirar los sobrenadantes. Añadir 1 ml prequilibrado a 37 °C/5% de CO₂ CM para resuspend cada pellet celular utilizando un micropipettor P1000. Sembrar las células de cada fracción en un matraz T75 de 1/3 MEF preequilibrado con CM (preparado según el paso 1.2)
6. Cultivo a 37 °C/5% de_CO2 durante 24 horas en una incubadora de cultivos celulares.
7. Aspirar CM diariamente y reemplazar con CM recién preparado (como en el paso 1.2) durante aproximadamente dos semanas. Los cultivos de células pluripotentesP7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)muestran colonias humanas similares a tallos después de una semana y alcanzan ~80% de confluencia a los 9-11 días. Los cultivos de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)crecen principalmente como un césped de células similares a fibroblastos que alcanza la confluencia a los 11-13 días. En esta etapa, si es necesario, los cultivos celulares P4 y P7 se pueden utilizar para el cultivo consecutivo mediado por FACS TG30/GCTM-2 de subfracciones P4 o P7 (ver Figuras 2 y 3).

Resultados

hESC-derivados que son pluripotentes libres de células madre se pueden obtener por el paso consecutivo de las células de la subfracción P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg).

Informes anteriores han establecido que en cultivos estándar hESC coexiste una mezcla de subpoblaciones exhibiendo un gradiente de expresión de genes asociados a la pluripotencia^5,6,13. La detección combinada de antígenos de superficie celular como TG30 (CD9) y GCTM-2 permite la discriminación de una serie de subconjuntos de células en la etapa pluripotente y en diversas etapas de diferenciación temprana, como lo indica su expresión de marcadores de células madre y factores de transcripción específicos del linaje^5,6,13. De acuerdo con los informes anteriores, pudimos discriminar las células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)y P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)en la línea hESC-MEL1 utilizada para este estudio(Figura 1). Con este resultado, se procedió a recoger célulasdiferenciadas P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg)y células pluripotentes P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)para su posterior cultivo en los estudios descritos a continuación.

Investigamos si usando un acercamiento negativo de la selección podríamos purgar los hESCs indiferenciados de las poblaciones de la célula que experimentaban la diferenciación muy temprana de la fase (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Se utilizó un número definido de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)que se cultivaron consecutivamente post-FACS(Figura 2A)durante aproximadamente dos semanas, y se volvieron a analizar utilizando TG30/GCTM-2 FACS antes de la replating en cada pasaje. Los resultados mostraron que la subfracción P4 enriquecida para TG30 Neg-GCTM-2^Neg diferenció los tipos de células después de un paso consecutivo, y una presencia menor de células P7 (TG30^Hi-GCTM-2Hi)en el pasaje inicial(Figura 2A,Pasaje 1) finalmente desapareció después de un mayor paso, convirtiéndose en muestras libres de células madre pluripotentes(Figura 2A,Pasaje 3).

El enriquecimiento de las células pluripotentes hESC se puede lograr mediante la recolección de células TG30^Hi-GCTM-2^Hi células.

Sobre la base de observaciones anteriores utilizando este ensayo, esperaríamos un enriquecimiento de hESCs pluripotentes mediante la recolección de células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)que deberían formar colonias de hESC. Por lo tanto, también investigamos TG30/GCTM-2 FACS-mediada por passaging consecutivo de células pluripotentes P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). En estas culturas P7, el immunoprofiling de TG30/GCTM-2 FACS fue realizado antes de replating las células en cada paso y solamente las células de P7 (TG30^Hi- GCTM-2^hi)fueron recultivas. De esta manera, observamos que la mayoría de las células se localizaban en las subfracciones asociadas a la pluripotencia (P6 y P7), loque indica un enriquecimiento de las células pluripotentes que también mantenían una capacidad de diferenciación y generación de un pequeño porcentaje de células P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg)(Figura 3A). Además, los cultivos de células P7 mostraron un gran número de colonias similares a hESC durante el paso(Figura 3B),lo que también indica el mantenimiento del estado de pluripotencia.

Figura 1. Estrategia de clasificación representativa para obtener subfracciones TG30/GCTM-2 FACS. (A): Las suspensiones de celdas hES disociadas se clasifican como células individuales y los grupos o dobletes potenciales se recluyen con la dispersión hacia adelante para la altura y el área (FSC-H y FSC-A). B): Los desechos potenciales se eliminan con FSC-A y SSC-A, y solo las células intactas se clasifican aún más. C): Las células no viables se excluyen en función de la fluorescencia del yoduro de propidio (PI) (FSC-A y FL3-A). (D): Las células alimentadoras de MEF fueron cerradas por la selección negativa basada en la expresión del ratón CD90.2-PE (FL2-A y SSC-A). E): La fracción hESC viable aislada, libre de alimentadores MEF, es finalmente fraccionada en subpoblaciones P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)y P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi). La puerta negativa (TG30^Neg-GCTM-2^Neg,llamada P4) se estableció de acuerdo con la autofluorescencia de fondo para las células no manchadas y también con los controles de isotipo. F): Porcentajes de las diferentes subpoblaciones cerradas típicas de un análisis de citometría de flujo TG30/GCTM-2. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figura 2. Cultivos consecutivos representativos de células P4 espontáneamente diferenciadas (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)de la línea hESC-MEL1. (A): Gráficas representativas de FACS TG30/GCTM-2 que muestran subconjuntos bloqueados de células (P4, P5, P6 y P7) discriminadas por el nivel de expresión detectada de los marcadores de superficie celular TG30 y GCTM-2. Una población inicial de 400.000 hESC-derivados que exhiben P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)inmunoprofilación se recoge de cultivos a granel de la línea hESC-MEL1. Estas células P4 (TG30 Neg-GCTM-2^Neg)se pasan consecutivamente post-FACS en condiciones favorables para la renovación de hESC en matraces T75, hasta alcanzar la confluencia (11-13 días). Antes de cada pasaje, TG30/GCTM-2 FACS se realiza para recoger y reculturar sólo el P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)tipos de células diferenciadas. B): Morfología típica del césped de células diferenciadas P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)después de 14 días. C): Esporádicas hESC-como colonias vistas después de 14 días entremezcladas con el césped de P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)células en el paso 1 solamente, son generados muy probablemente contaminando P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)células. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Figura 3. Las células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)derivadas de líneas hESC pueden pasarse consecutivamente post-FACS sin perder sus propiedades pluripotentes intrínsecas. Inmunoprofilado TG30/GCTM-2 FACS representativo de los diferentes pasajes consecutivos, mostrando los subconjuntos discriminados de células (P4, P5, P6 y P7) según el nivel de expresión de TG30 y GCTM-2. (A): Una población inicial de 400.000 células que muestran las características P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)se recupera de cultivos a granel de la línea hESC-MEL1. Las células Pluripotentes P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)se pasan consecutivamente post-FACS en condiciones de apoyo para la renovación de hESC en matraces T75, hasta alcanzar ~80% de confluencia (9-11 días). El inmunoprofilado TG30/GCTM-2 FACS se realiza antes de replating las células en cada paso y sólo las células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)se reculban. Los resultados muestran que lascélulas P7 (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)conservan sus características pluripotentes con el paso posterior, incluyendo la conservación de la expresión (TG30 Hi-GCTM-2^Hi),formando colonias similares a hESC (mostradas en B)y manteniendo la capacidad de diferenciarse como se puede inferir de la recapitulación de una pequeña fracción de P4 diferenciado (TG30^{Neg-GCTM-2Neg)}en cada uno de los gradientes FACS. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver la figura más grande.

Muestra (volúmenes de reacción)	Anticuerpo primario	Anticuerpo secundario	Rata PE Anti-Ratón CD90.2 b	Yoduro de propidio c
Muestra de clasificación (~ 9 ml para ABs primarios, 2.5 ml para ABs secundarios)	(TG30 + GCTM-2) a	AF 488 cabra anti-ratón IgG2a + AF 647 cabra anti-ratón IgM	+	+
Control-1: TG30 (200 μl)	TG30	AF 488 cabra anti-ratón IgG2a	-	+
Control-2: GCTM-2 (200 μl)	GCTM-2	AF 647 cabra anti-ratón IgM	-	+
Control-3: Anti-ratón CD90.2 (200 μl)	-	-	+	+
Control-4: Ficoeritrina (PE) (200 μl)	Isotipo igG2a del ratón	R-phycoerythrin cabra anti-ratón IgG2a	-	+
Control-5: Isotipo de inmunoglobulina de ratón (200 μl)	Isotipo IgG2a del ratón + isotipo de IgM	AF 488 cabra anti-ratón IgG2a + AF 647 cabra anti-ratón IgM	-	+
Control-6: Células no manchadas (200 μl)	-	-	-	-

Tabla 1. Ordenar muestras y controles para la clasificación facs. ^a La muestra de clasificación se inmunotaine simultáneamente con los anticuerpos TG30 y GCTM-2. ^b PE-anti-ratón CD90.2 se utiliza para reconocer las células del ratón y para quitar mefs de los hESCs durante FACS^{14. c} Las células no viables se excluyen utilizando yoduro de propidio a una concentración final de 0,3 μg/ml. Reactivo añadido (+), no añadido (-) al tubo de reacción.

anticuerpo	anfitrión	isotipo	Dilución de trabajo
TG30 (1,4 mg/ml)	ratón	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (sobrenadante de hibridoma)	ratón	Igm	1:5 ~ 1:10 a
AF 488 cabra anti-ratón IgG2a	cabra	Policloonal	1:500
AF 647 cabra anti-ratón IgM	cabra	Policloonal	1:500
R-phycoerythrin (PE) cabra anti-ratón IgG2a	cabra	Policloonal	1:1,000
CD90.2 anti-ratón	rata	IgG2b	1:100
Ratón purificado IgG2a, κ Control de isotipos	ratón	IgG2a	1:200
IgM de ratón purificado, κ Control de isotipos	ratón	Igm	1:200

Tabla 2. Detalles de anticuerpos y diluciones para clasificación facs. a ^Debido a la expresión extremadamente muy alta de GCTM-2 en la superficie celular de las hESC, no es posible alcanzar la saturación con este anticuerpo. Cada lote de sobrenadante de hibridoma GCTM-2 debe ajustarse contra un control estándar o un lote anterior para obtener resultados similares con hESCs en escala y evitar manchas excesivas.

Nombre del medio	composición
Medio hESC/KOSR	Medio de águila modificado de Dulbecco: Mezcla nutritiva F-12 (DMEM/F-12) complementada con el reemplazo del suero del golpe de gracia del 20% (KOSR), 2 milímetros GlutaMAX, aminoácidos no esenciales del MEM del 1%, 0,1 milímetros 2-Mercaptoetanol, factor de crecimiento humano 2 del fibroblasto de 10 ng/ml (FGF-2) y pluma/estreptocococo en 1x.
Medio MEF	Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose (DMEM) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM GlutaMAX, and Pen/Strep at 1x.

Tabla 3. Composición de los medios de cultivo.

Discusión

En el contexto clínico, los tipos de células somáticas diferenciadas son el producto final deseado para trasplantes y aplicaciones terapéuticas, y los hPSC son una fuente auto-renovadora y escalable para generar esas células somáticas o sus progenitores en el laboratorio. La presencia de hESCs indiferenciados residuales con un potencial inherente para la formación del teratoma es un riesgo de seguridad al considerar las células somáticas hESC-derivadas para el trasplante en pacientes. Para una revisión de este y otros riesgos asociados con la terapia celular, consulte Sharpe et al. ¹⁶ Por lo tanto, para realizar tales aplicaciones, es imperativo que los investigadores apunten a generar poblaciones de células objetivo que también estén libres de células madre pluripotentes. Con este fin, demostramos aquí que utilizando nuestra metodología TG30/GCTM-2 FACS es posible monitorizarla presencia de células pluripotentes (TG30 Hi-GCTM-2^Hi)en una población celular diferenciadora y obtener derivados viables diferenciados por hESC que pueden ser enriquecidos y recultivos post-FACS. Aunque no es posible obtener muestras 100% libres de células madre pluripotentes con una sola pasada de nuestro protocolo, los derivados de hESC enriquecidos se pueden recultivar y después de pasar consecutivamente se alcanza una pureza de células somáticas del 100%. La viabilidad demostrada de las células somáticas para la expansión post-FACS también permite potencialmente la producción de un número adecuado de células adecuadas para posibles terapias de trasplante.

Los resultados alentadores de este estudio piloto nos llevaron a realizar una investigación más completa utilizando nuestro protocolo TG30/GCTM-2 en un estudio comparativo con varias líneas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC)^15. En ese estudio, encontramos que las muestras libres de células madre pluripotentes obtenidas utilizando nuestro protocolo TG30/GCTM-2 FACS no generaron teratomas cuando se trasplantaron a ratones inmuno-privados. Por lo tanto, podemos afirmar con confianza que con el uso de este protocolo in vitro, los cultivos celulares de diferenciación en etapa temprana determinados como libres de células pluripotentes TG30 Hi-GCTM-2^Hi no desarrollan teratomas in vivo. Esto apoya fuertemente la robustez de nuestro análisis, proporcionando un acercamiento potencial para eliminar el riesgo de formación del teratoma antes del uso de células hPSC-derivadas en usos clínicos.

Por el contrario, también mostramos que el ensayo TG30/GCTM-2 FACS se puede utilizar para recuperar una población celular pluripotente con alto nivel de expresión de estos dos antígenos de superficie (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Estudios anteriores han demostrado que las células TG30^Hi-GCTM-2^Hi exhiben la mayor correlación con la expresión^{de OCT4 hi} y forman el mayor número de colonias similares a hESC^5,6,13,15. Por lo tanto, razonamos que la red de pluripotencia se activa en sus niveles máximos en las células que expresan TG30^Hi-GCTM-2^Hi. Consideramos que el uso de nuestro protocolo TG30/GCTM-2 FACS y la recuperación de células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)podría permitir la purificación a gran escala de cultivos de hESC vivos enriquecidos, como entradas para ensayos de diferenciación.

En conclusión, demostramos aquí la potencialidad de nuestros ensayos facs basados en la expresión combinada de antígenos de superficie TG30 y GCTM-2 para la purga y el enriquecimiento de hESCs. Los estudios futuros con los protocolos para la diferenciación dirigida de hPSCs son probables también ser informativos con respecto a esta potencialidad. Somos conscientes de que en algunos ensayos donde los derivados diferenciados de hESC expresan temporalmente TG30 (CD9) o GCTM-2, estos dos anticuerpos podrían no ser apropiados o suficientes para purgar las células pluripotentes de una población diferenciada en un momento determinado en el ensayo^6. Por lo tanto, hay una necesidad continua de encontrar los anticuerpos nuevos que reconozcan específicamente los hESCs vivos para superar la limitación posible de la cruz-reacción con algunos tipos diferenciados de la célula.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM / F-12	Life Technologies	11320082	Nombre largo: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Mezcla de nutrientes F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Nombre largo: Reemplazo de suero knockout
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Nombre largo: Suplemento de GlutaMAX
Aminoácidos no esenciales Life	Technologies	11140050	Nombre largo: MEM Solución de aminoácidos no esenciales
Mercaptoethanol	Life Technologies	21985023	Nombre largo: 2-Mercaptoethanol
DPBS	Life Technologies	14190250	Nombre largo: Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, sin calcio, sin magnesio
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	Nombre largo: TrypLE Express (1x), sin rojo fenol
AF-488	Life Technologies	A21131	Nombre largo: Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Nombre largo: Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	Nombre largo: R-ficoeritrina cabra anti-ratón IgG2a (γ 2a) Conjugado
DMEM	Life Technologies	11965-092	Nombre largo: Dulbecco's Modified Eagle Medium, alta glucosa
/Strep	Life Technologies	15140-122	Nombre largo: Penicilina-estreptomicina,
agua destilada	Life Technologies	15230-089.	Nombre largo: Agua destilada estéril
PI	SIGMA	P4864	Nombre largo: Solución de yoduro de propidio
FBS	SIGMA	12203C	Nombre largo: Gelatina de suero bovino fetal
	SIGMA	G-1890	Nombre largo: Gelatina de piel porcina
humana FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Nombre largo: Factor de crecimiento de fibroblastos básico, recombinante humano, libre de animales
Filtro 0.22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	Nombre largo: Stericup-GP, 0.22 μ m, polietersulfona, 250 ml, radioesterilizada
70 μ m Filtro de células	Becton Dickinson	352350	Nombre largo: Filtro de células con 70 μ m Malla de nylon
35 μ m Filtro de células con tapa, tubo de 5 ml	Becton Dickinson	352235	Long Nombre: Tubo de ensayo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml, con tapa de filtro de células (35 μ m)
5 ml Tubo de ensayo de fondo redondo de poliestireno	Becton Dickinson	352054	Nombre largo: Tubo de ensayo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml,
control de isotipo IgG2a	Becton Dickinson	554126	Nombre largo: Ratón purificado IgG2a, κ Control de isotipo
IgM Control de isotipo	Becton Dickinson	553472	Nombre largo: IgM de ratón purificado, κ Control de isotipo
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Nombre largo: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
calibración de 8 picos	Becton Dickinson	559123	Nombre largo: Partículas de calibración arco iris (8 picos)
Tubo de polipropileno estéril de 50 ml	Greiner Bio-One	227261	Nombre largo: Tubo de polipropileno de 50 ml con fondo cónico,
matraz estéril T75	Greiner Bio-One	658175	Nombre largo: CELLSTAR Tapa de filtro Cultivo celular 75 cm2 Frascos
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Nombre largo: Anticuerpo TG30, clon TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Nombre largo: GCTM-2 no está disponible comercialmente, pero TG343 y el anticuerpo monoclonal equivalente sí lo es
Tabla 4. Lista de materiales y reactivos
Máquina FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE con opción FACSDiva
Microscopio invertido	Olympus		IX71
Table 5. Lista de equipos.