Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Resumen

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Resumen

En la naturaleza, rara vez existen bacterias en forma aislada, sino que están en vez rodeados por una gran variedad de otros microorganismos que alteran el medio ambiente local mediante la secreción de metabolitos. Estos metabolitos tienen el potencial de modular la fisiología y la diferenciación de sus vecinos microbianos y son factores importantes que puedan en el establecimiento y mantenimiento de las comunidades microbianas complejas. Hemos desarrollado una pantalla de cocultivo basado en la fluorescencia para identificar tales interacciones microbianas mediadas químicamente. La pantalla se combina una transcripción cepa fluorescente reportero con microbios ambientales en medios sólidos y permitiendo que las colonias crezcan en cocultivo. El reportero transcripcional fluorescente está diseñado de manera que la cepa bacteriana elegida emite fluorescencia cuando se está expresando un fenotipo particular de interés (es decir, la formación de biopelículas, la esporulación, la producción de factor de virulencia, etc.) El cribado se realiza en condiciones de crecimiento where este fenotipo no se expresa (y por lo tanto la cepa reportero es típicamente no fluorescente). Cuando un microbio ambiental segrega un metabolito que activa este fenotipo, que se difunde a través del agar y activa el constructo indicador fluorescente. Esto permite que el productor de metabolitos de inducción de microbio a detectar: ​​son las colonias no fluorescentes más proximales a las colonias fluorescentes. Por lo tanto, esta pantalla permite la identificación de los microbios ambientales que producen metabolitos difusibles que activan una respuesta fisiológica particular, en una cepa reportero. Esta publicación explica cómo: a) seleccionar las condiciones de selección adecuadas co-cultivo, b) preparará el reportero y microbios ambientales para la detección, c) realizar la pantalla de co-cultivo, d) aislar organismos putativo inducir, y e) confirmar su actividad en una pantalla secundaria. Hemos desarrollado este método para la detección de organismos del suelo que activan biopelícula matriz de producción en Bacillus subtilis

Introducción

Estamos interesados ​​en la comprensión de cómo los metabolitos que las bacterias secretan afectan la fisiología y el desarrollo de los microbios vecinos. Muchos metabolitos se han caracterizado por sus efectos bioactivos sobre otros microbios. Dos ejemplos bien descritos incluyen antibióticos, que inhiben el crecimiento de otros microbios, y las moléculas de detección de quórum, que alteran la expresión génica global de otros microbios. Sin embargo, las bacterias producen muchos otros pequeños productos naturales de molécula que no tienen bioactividades conocidos ^1. Nuestra hipótesis es que las bacterias han evolucionado y conservado la capacidad de produ....

Protocolo

1. Seleccionar un gen informador y Construir un reportero fluorescente transcripcional

Para B. subtilis:

1. Consulte el artículo de Jove en referencia ¹⁹ para un protocolo que describe la construcción de marcadores transcripcionales fluorescentes en Bacillus subtilis.

Para otras especies bacterianas:

1. Identificar un gen que se regula positivamente durante la respuesta fisiológica de interés. Esto puede basarse en la bibliografía existente o análisis transcripcional del microbio en condiciones particulares.
2. Construir un reportero transcri....

Resultados

Se utilizó este pantalla para identificar los organismos del suelo secretoras de compuestos que alteran la fisiología de B. subtilis. Los resultados descritos aquí se centran en el tipo de célula-matriz de la producción de B. subtilis, que produce la proteína y de exopolisacáridos que se requieren para la formación de biopelículas robusta en esta bacteria. Seleccionamos el promotor del operón tapa-sipW-TASA para nuestra construcción informadora fluorescente (P _tapa-YFP). Es.......

Discusión

Una de las limitaciones inherentes de este protocolo es que se basa en la cultivabilidad de organismos microbianos. Como ha sido bien documentado ^24, mayoría de la vida microbiana en el planeta no puede (aún) ser cultivado bajo las condiciones de cultivo explorados hasta la fecha. Por lo tanto, un gran número de interacciones entre especies microbianas que se están produciendo en los entornos naturales no sea detectada utilizando este enfoque. Sin embargo, ya que es nuestro deseo para identificar no sólo la e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Espectrofotómetro			Cualquier espectrofotómero capaz de medir valores de OD600 absorbancia.
Caldo Luria, Lennox	VWR	80017-484	Pueden ser necesarias fuentes de medios alternativas.
Perlas de vidrio, 3 mm	VWR	26396-508
Puntas de carga de gel, redondas	VWR	29442-666
Varillas de vidrio	VWR	59060-069
Estereoscopio de disección de fluorescencia	Zeiss	N/A	El autor utilizó un estereoscopio de disección Zeiss Stemi SV6 con una fuente de luz fluorescente EXFO X-cite 120, un cubo de filtro YFP de paso largo, un objetivo acromático de 0,63X, oculares de 10X y un Cámara digital Axio HRC HR. La mayor parte del cribado se realizó con la montura de enfoque a 2.0-3.2X. Cualquier estereoscopio de disección con capacidad de fluorescencia está bien, siempre que tenga los filtros correctos para el FP que está utilizando. Lo mejor es que haya un obturador que permita cambiar fácilmente entre campo claro y fluorescente, así como una platina que permita la iluminación desde arriba y desde abajo. Si desea capturar imágenes, también es necesaria una cámara adjunta.