Artículo de método

La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia

DOI:

10.3791/50868

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30 de octubre de 2013

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1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

En este artículo

Resumen

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Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.

Resumen

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Un modelo preclínico de cáncer de vejiga invasivo fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) transgénicos (MUC1.Tg) ratones para el propósito de la evaluación de la inmunoterapia y / o quimioterapia citotóxica. Para inducir el cáncer de vejiga, C57BL / 6 ratones (tipo MUC1.Tg y silvestres) fueron tratados por vía oral con el carcinógeno N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / día, 5 días / semana durante 12 semanas. Para evaluar los efectos de OH-BBN en el perfil de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor, sangre total se recogió a través de hemorragias submandibulares antes del tratamiento y cada cuatro semanas. Además, una vacuna de péptido MUC1-específica y el placebo se administraron a grupos de ratones a la semana durante ocho semanas. Se realizaron Multiplex fluorométricos inmunoanálisis microperlas de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor y después de la vacunación. A la terminación, el interferón gamma (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análisis de ELISPOT para MUC1 respuesta inmune de células T específica y evaluaciones histopatológicas de tipo de tumory se realizaron grado. Los resultados mostraron que: (1) la incidencia de cáncer de vejiga en ratones de tipo salvaje tanto MUC1.Tg y fue de 67%; (2) carcinomas de células transicionales (TCC) desarrollados en la relación 2:1 en comparación con carcinomas de células escamosas (SCC) ; (3) las citoquinas inflamatorias se incrementaron con el tiempo durante el desarrollo del tumor, y (4) la administración de la vacuna de péptido induce un perfil de citoquinas Th1-polarizado suero y una respuesta de células T específica MUC1. Todos los tumores en ratones MUC1.Tg fueron positivos para la expresión de MUC1, y la mitad de todos los tumores en ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg eran invasiva. En conclusión, el uso de un enfoque de equipo a través de la coordinación de los esfuerzos de los farmacólogos, inmunólogos, anatomopatólogos y biólogos moleculares, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico intacto inmunológico del cáncer de vejiga que expresa hMUC1.

Introducción

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El cáncer de vejiga es el cuarto tipo de cáncer más común y la octava causa de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses. En los Estados Unidos, se espera que unos 72.500 nuevos casos y 15.000 muertes por cáncer de vejiga entre los hombres y mujeres en conjunto en 2013 1. La incidencia de cáncer de vejiga es aproximadamente tres veces mayor en los hombres que en las mujeres. En los Estados Unidos, carcinomas de células transicionales (TCC) representan más del 90% de los casos, mientras que los carcinomas de células escamosas (SCC) tienen una incidencia de menos de 2% 2. La tasa de supervivencia a 5 años relativa global para papilar TCC es 91,5% frente a sólo el 30,9% de SCC 2. Aunque los TCC papilares no invasivos representan aproximadamente el 75% de los casos en el momento del diagnóstico, incluso con el tratamiento de más de 50% de los pacientes experimentará una recurrencia dentro de 5 años, con un máximo de 30% de estos pacientes progresa a la enfermedad invasiva del músculo 3,4 . Pautas de tratamiento habituales para inv no músculoenfermedad ASIVE incluye la resección transuretral (TUR) seguida de quimioterapia intravesical. En pacientes con Ta de alto grado o tumores T1, una repetición TUR se puede realizar antes de la quimioterapia 3,4. Para aquellos pacientes con recurrencias Ta de bajo grado o Ta de alto grado o lesiones T1, RTU seguida de quimioterapia o inmunoterapia adyuvante en la forma de bacilo de Calmette-Guerin (BCG) se puede usar 3,4. Intravesical de BCG se ha demostrado ser superior a la mitomicina C intravesical con respecto al tiempo hasta la recurrencia 5. Para la enfermedad invasiva del músculo T2, la cistectomía radical con o sin quimioterapia neoadyuvante es el tratamiento recomendado 3. En los pacientes con SCC, la cistectomía radical parece ser el tratamiento más efectivo 6. Dadas las altas tasas de recurrencia a pesar de los tratamientos disponibles, existe una clara necesidad de nuevas terapias más eficaces para el cáncer de vejiga.

Ampliar nuevas inmunoterapias para Bladdcáncer er es un posible enfoque que puede mantener la promesa para prolongar la supervivencia libre de enfermedad. Históricamente, BCG ha sido la única inmunoterapia eficaz para el cáncer de vejiga. Se cree que su mecanismo de acción para involucrar a la inducción no específica de una respuesta inmunitaria de tipo T helper 1 (Th1) a través de aumento de los niveles de interleucina-2 (IL-2) y el interferón gamma (IFN-γ) 4. Celular, o la inmunidad Th1, es crítico en la inmunoterapia del cáncer como humoral, o Th2, inmunidad nunca se ha demostrado ser eficaz contra los tumores sólidos, con la excepción de anticuerpos dirigidos contra los receptores del factor de crecimiento 7. En un intento de mejorar los beneficios de BCG monoterapia, IFN-α combinación 2B/BCG inmunoterapia se evaluó en un ensayo clínico de fase II con resultados no concluyentes 8. Una aproximación alternativa a la inmunoterapia para el cáncer de vejiga puede ser para dirigir antígenos asociados a tumores (TAA), la identificación de lo que ha hecho la inmunoterapia del cáncer más específica 7 .

Uno de estos TAA es mucina 1 (MUC1), que es una glicoproteína de superficie celular sobreexpresados ​​en muchos cánceres de células epiteliales, tales como la vejiga, de mama, de pulmón, y cáncer de páncreas 9,10. La expresión y la modificación de MUC1 también se altera sustancialmente durante la carcinogénesis, de tal manera que underglycosylation expone secuencias antigénicas de aminoácidos conocidos como número variable de repeticiones en tándem (VNTR) en el núcleo peptídico. Mientras MUC1 es una auto-molécula, estas regiones VNTR inmunodominantes no están normalmente expuestos debido a la amplia glicosilación, y por lo tanto son vistos por el sistema inmune como 11,12 extranjera. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen específicamente epítopos de MUC1 se han aislado de los ganglios linfáticos que drenan el tumor de los pacientes de cáncer de mama 13, así como la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma 14,15, haciendo MUC1 un blanco potencial para un respuesta inmune celular. Los VNTR inmunodominantes de la underglycosylated forma de MUC1 son reconocidos por CTL, lo que resulta en la destrucción de las células tumorales 16-19. La respuesta inmune celular y / o humoral nativos a MUC1 cancerosos son, sin embargo, no lo suficientemente fuerte como para eliminar los tumores. Para aumentar la respuesta inmune débil ya existente para MUC1, péptidos inmunodominantes sintéticos se pueden introducir a través de la vacunación para generar una respuesta de CTL lo suficientemente fuerte para ser de beneficio clínico 18,20. Una vacuna liposomal MUC1 ya se ha demostrado que aumenta la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón 21,22, generar CTL capaces de matar las células tumorales positivas para MUC1, y producir una respuesta de citoquinas Th1-polarizado 23,24. Con un alto nivel de expresión de MUC1 9,11,25, cáncer de vejiga es un candidato lógico para probar MUC1-inmunoterapia dirigida 26,27. Además, MUC1 tiene potencial como factor pronóstico en el cáncer de vejiga 28, MUC1 expresión en TCC se asoció significativamente con el estadio y grado, y metastásicos TCCse ha demostrado que continuar expresando MUC1 29.

Con el fin de evaluar la utilidad potencial de la inmunoterapia MUC1-dirigida en el cáncer de vejiga, hemos desarrollado un MUC1 humano intacto inmune (hMUC1)-expresando transgénico (MUC1.Tg) modelo de ratón de congenic cáncer de vejiga en los C57BL / 6 de fondo 30. MUC1 humana se expresa como un auto-proteínas bajo el control de su propio promotor, que resulta en un patrón de expresión de tejido consistente con la observada en los seres humanos 30,31. Los ratones se indujeron con el conocido carcinógeno vejiga N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) 32, y a continuación, se evaluaron los tumores resultantes para hMUC1 expresión y el tipo y grado del tumor. Para evaluar el efecto de la sustancia cancerígena en los niveles de citoquinas Th1/Th2 durante el desarrollo de tumores, se recogieron muestras de suero periódicamente para el análisis múltiplex. Los ratones fueron tratados con una vacuna de péptido MUC1-específica, y la citoquina en suero y respuestas inmunes eran evaluaciónted por múltiplex inmunoensayo fluorimétrico microbead y ELISpot.

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Protocolo

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Todos los estudios con animales y los experimentos se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado por la Universidad de California, Davis Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comité Consultivo administrativa.

1. MUC1.Tg ratón obtención y la reproducción

  1. El Programa de Biología del Ratón Davis UC (MBP) razas de tipo salvaje C57BL / 6 ratones machos con heterocigotos MUC1.Tg C57BL / 6 ratones hembra para establecer nuestra colonia. MUC1.Tg crías se entregan los estudios según sea necesario.
  2. Personal de MBP clip de los dedos de la descendencia en un patrón definido (0-99) para la identificación del ratón y, cuando proceda, el clip de la cola. El dedo o el tejido de la cola se procesan para el genotipado mediante la extracción de ADN estándar y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), análisis.

2. Diseño del estudio

  1. Estudio actividades en grupo
    1. Pesar cada ratón por separado en una balanza y se registra el peso en gramos para cada ratón.
    2. Esta parte del procedimiento de invOlves la metodología y el diseño del estudio. Para la primera parte del estudio, asignar emparejados por edad ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg para iniciar la inducción de cáncer de vejiga con OH-BBN. La eutanasia a los ratones 8 semanas después de la última dosis OH-BBN para confirmar la presencia de tumores en la vejiga por la histología.
    3. Para la segunda parte del estudio, los ratones aleatoriamente MUC1.Tg macho en el número apropiado de grupos de tratamiento y control. Estos ratones serán monitorizados para citoquinas en suero y respuestas inmunes de células T durante la inducción y el desarrollo del tumor, y luego a la terminación del estudio de 8 semanas después de la última dosis OH-BBN.
  2. Inducción de cáncer de vejiga
    1. OH-BBN es un agente cancerígeno y altamente tóxico. Por favor, lea y siga las instrucciones de la ficha de datos de seguridad de materiales para la manipulación y almacenamiento de este producto químico.
    2. Calcular la concentración de la solución de dosificación necesaria para administrar la dosis apropiada (3 mg), en un volumen de 100 l, a cada ratón en base a los pesos medios y Number de los ratones en cada estudio y de grupo.
    3. Diluir el OH-BBN en etanol 100%. Llevar la concentración final de 30 mg / ml con agua estéril. El final de etanol: concentración de agua debe ser 20:80, v / v
    4. Administrar el OH-BBN por vía oral usando el acero inoxidable, 20 G agujas por sonda diariamente, 5 días / semana durante 12 semanas, con base en el grupo de asignación de tratamiento a partir de la edad de 8 semanas.
  3. Tratamientos de vacunación
    1. Reconstituir cada vial de vacuna de péptido liofilizado en 600 l de 0,9% de solución salina estéril y resuspender a fondo por el dibujo de la solución a través de un 0,5 pulgadas aguja G 27 6x. Uso de solución salina, ajustar la concentración de manera que la dosis deseada se administra en un volumen de 100 l.
    2. Comenzando en la semana 20, después de la última dosis de OH-BBN, administrar la vacuna en una base semanal de un ciclo de ocho semanas mediante inyección subcutánea de 100 l usando una aguja de calibre 25 (número de semanas se corresponde con la edad de los ratones).
  4. Monitoreo y Toma de Muestras
    1. Pesar todos los ratones y palpar la presencia de nuevos tumores una vez cada semana. La eutanasia a los ratones que han perdido ≥ 20% del peso corporal o si hay tumores palpables, sangre en la orina, y / o retención urinaria.
    2. Antes de la primera dosis OH-BBN y luego a intervalos de 4 semanas a partir de entonces, recoger la sangre entera a través de las hemorragias submandibulares. Recoger la sangre en tubos de coagulación de suero Microtainer (BD), y 30 min para permitir que la sangre se coagule.
    3. Centrifugar las muestras de sangre en una microcentrífuga a 3500 xg durante 10 min. Transferir cuidadosamente el suero para atornillar criotubos tapa utilizando una pipeta.
    4. Flash congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su posterior análisis multiplex.
    5. Ocho semanas después de la última dosis de OH-BBN, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2.
    6. Coloque cada ratón en una tabla de disección y precisar por las cuatro extremidades.
    7. El uso de pinzas y tijeras, make una incisión horizontal en la región abdominal superior. Insertar las tijeras en la incisión entre la capa de la epidermis y de la pared abdominal y separar suavemente la piel del tejido subyacente con la ayuda de fórceps.
    8. Hacer una incisión vertical desde la incisión horizontal siguiendo el eje central hacia el extremo anterior del ratón. Separar la piel de la caja torácica, y el uso de una jeringa de 1 ml y una aguja de 22 G, perforar el corazón y recoger la sangre con un empate suave y constante.
    9. Consulte el paso 2.4.3 y 2.4.4 para el aislamiento y almacenamiento de suero.
    10. El uso de pinzas y tijeras, cortar y pelar el resto de la capa epidérmica. Corte a través de la pared abdominal y peritoneo y asépticamente extraer el tumor de vejiga de inmunohistoquímica (IHC) y Western blot.
    11. Recoger el bazo para el análisis de la viabilidad celular (Musa) y ELISPOT. Para IHC, lugar vesical tumoral en casete de tejido y fijar en formalina durante la noche refrigerada a temperatura ambiente.
    12. El día siguiente, reemplazar la formalina con etanol al 70%.
    13. Para el análisis de transferencia de Western de tumor, homogeneizar el tumor, añadir tampón de extracción de proteínas más inhibidores de la proteasa detener y transferir a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    14. Vortex durante 30-60 segundos y mantener en hielo durante 5 min. Flash congela en nitrógeno líquido y descongelación en agua a temperatura ambiente. Repita el proceso de agitación, la congelación y descongelación dos veces.
    15. Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir los extractos celulares a nuevos tubos etiquetados.
    16. Cuantificar la concentración mediante la realización de un ensayo de proteína del ácido bicinconínico (BCA) para mediciones de la proteína. Almacene las muestras a -80 ° C hasta el momento de Western blot.

3. Biología Molecular / Western

Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo para verificar la expresión de MUC1 en la vejiga del ratón tejido tumoral utilizando el protocolo de transferencia Western estándar (datos no muestrann).

  1. Separar los extractos de proteínas por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y luego se transfieren a una membrana de PVDF utilizando un aparato semiseco.
  2. Bloquear la membrana de la proteína transferida con 5% de leche sin grasa en 0,1% de Tween-20 en tampón fosfato salino (PBS-T) de pH 7,4 durante 1 hora en un agitador orbital a temperatura ambiente.
  3. Se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador con anticuerpo anti-MUC1 o anti-β-actina en 0,1% de PBS-T.
  4. Lavar la membrana por decantación la solución y la adición de 0,1% de PBS-T. Remolino de la membrana en el agitador durante 5 minutos y se decanta. Repita este paso dos veces.
  5. Se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con anticuerpo secundario.
  6. Lave 3 veces (consulte el paso 3.4).
  7. Siga el protocolo para el kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para activar y leer el fluorografía.

4. Multiplex Fluorometric Inmunoensayo microcuentas

  1. Configuración y Cálculos
    1. Usar un mapa placa de 96 pocillos, ceder espacios en blanco, estándares, controles y muestras problema a los pocillos. Calcular el número y el volumen de analitos, la captura de anticuerpos y estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) necesario para el ensayo.
    2. Permitir que todos los tampones y diluyentes alcancen la temperatura ambiente. Preparar los estándares y las diluciones de muestra usando una placa de 96 pocillos en blanco.
    3. Reconstituir la matriz de suero y estándar liofilizada de acuerdo con el protocolo del fabricante y hacer diluciones seriadas 1:05 de la norma con el diluyente apropiado en la placa de 96 pocillos. Para los pocillos de blanco, utilizar el diluyente apropiado.
    4. Diluir todos los controles y muestras desconocidas 1:02 en el diluyente apropiado en el resto de la placa de 96 pocillos.
    5. Para la mezcla de microesferas, pipetear el volumen requerido de diluyente apropiado en un tubo de 15 ml. Vortex cada vial de microesferas durante 20 seg y la pipeta el volumen requerido de cada analito en el tubo de 15 ml.
    6. Proteja siempre las cuentas de la luz para evitar photobleaching. No coloque la placa de 96 pocillos con material absorbente para evitar la pérdida de la muestra por capilaridad.
  2. Protocolo de ensayo
    1. Prehumedecido la placa de 96 pocillos de fondo filtro con 200 l de tampón de ensayo y permitir la impregnación completa del filtro. Drenar suavemente utilizando el aparato de vacío placa de 96 pocillos y secar la parte inferior de la placa con una toalla de papel.
    2. Con una pipeta multicanal, pipetas 25 l de matriz de suero en los pocillos asignados a los blancos y patrones y pipeta de 25 l de tampón de ensayo a los pocillos asignados a los controles y las incógnitas.
    3. Pipetear 25 l de la pieza en bruto, las normas, controles y desconocidos a los respectivos pozos asignados. Agite la mezcla de microesferas durante 20 segundos y transferir las cuentas a un depósito.
    4. Pipetear 25 l de la mezcla de microesferas en cada pocillo. Cubrir la placa con papel de aluminio o una placa de tapa opaca para protegerlo de la luz.
    5. Agitar la placa a 500 rpm durante dos horas a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% de Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS-T) dos veces. Escurrir y secar.
    6. Prepare la solución de anticuerpo de captura. Pipetear la cantidad requerida de 0,1% de PBS-T y anticuerpo de captura en un tubo de 15 ml y agitar durante 10 seg. Transferir la mezcla de anticuerpo de captura a un depósito y la pipeta 25 l en cada pocillo.
    7. Agitar la placa a 500 rpm durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% PBS-T dos veces. Escurrir y secar.
    8. Prepare la solución de SA-PE. Pipetear el volumen requerido de 0,1% de PBS-T y SA-PE en un tubo de 15 ml y agitar durante 10 seg. Transferir la solución a un depósito y la pipeta 25 l en cada pocillo.
    9. Agitar la placa a 500 rpm durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% PBS-T dos veces. Escurrir y bmuchos seco.
    10. Pipetear 100 l de 0,1% de PBS-T y agitar en un agitador de placas a 500 rpm durante al menos dos minutos para resuspender las perlas. Leer y analizar la placa en la máquina LX200 Luminex.

5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Preparación y Análisis

  1. En una cabina de seguridad biológica, procesar los bazos a través de tejido de nylon 100 micras tamices en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en placas de Petri estériles. Capa de los esplenocitos en 3 ml de medio de separación de linfocitos en tubos estériles de 15 ml.
  2. Centrifugar los tubos a 600 xg durante 15 minutos para separar los linfocitos de las células rojas de la sangre. La transferencia de los linfocitos en capas por encima de la pendiente de nuevos tubos estériles de 15 ml.
  3. Ajuste el volumen a 10 ml con PBS estéril. Centrifugar la suspensión a 600 xg durante 10 min para sedimentar las células.
  4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS para la viabilidad celular y contar con la Musaanalizador. Siga el conde Muse y protocolo Kit Viabilidad.
  5. Hacer diluciones seriadas de los linfocitos en 1,5 ml de tubos con cierre de tornillo centrifugar a factores de dilución de 1:10, 1:20 y 1:40 (o si necesario) de Count & Reactivo Viabilidad (mínimo volumen total 300 l). Pipetear cada dilución arriba y abajo varias veces para mezclar y analizar en el Muse.
  6. Elaborar un mapa de la placa de las muestras y las condiciones para la placa ELISpot. Preparar la placa de ELISPOT de acuerdo con el protocolo del fabricante y pipeta de 100 l de medio, el péptido (10 g / ml), o péptido (10 g / ml) a cada pocillo lucha.
  7. Pipetear 100 l de suspensión celular, la entrega de 1,0 x 10 6 células a cada pocillo e incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
  8. Seguir el protocolo del fabricante para el ensayo ELISPOT. Analizar la placa ELISpot desarrollada usando un microscopio de disección.
  9. Cuantificar los resultados mediante el recuento del número de manchas de color corresponding a cada analito en cada pocillo. Los puntos corresponden al número de células formadoras de punto (SFC) en cada pocillo.

6. La inmunohistoquímica (IHC) y hematoxilina y eosina (H & E) tinción

  1. Tome el tejido tumoral de vejiga conservada como se describió anteriormente (sección 2.4.11), insertar en parafina y la sección paso a los 4 m para el análisis inmunohistoquímico.
  2. Realizar IHC usando un anticuerpo MUC1 que reconoce la región de repetición en tándem de MUC1. Utilice el kit de peroxidasa de Investigación de Animales para minimizar la reactividad del anticuerpo secundario del ratón con inmunoglobulina endógena presente en el tejido.
  3. Realizar H & E tinción utilizando protocolos estándar.

7. Métodos Estadísticos

Para el Multiplex Fluorometric Inmunoensayo microcuentas, utilice la prueba t de Student de dos colas para comparar el promedio observado concentraciones de citoquinas en suero entre los grupos de tratamiento y control. Para ELISpot, utilice una sola way ANOVA para comparar el punto de formación de colonias entre el control de los medios de comunicación, revueltos péptido y grupos de péptidos. Utilice prueba de comparación múltiple de Dunnett para disminuir la probabilidad de un resultado positivo falso. Un valor de p ≤ 0,05 se consideraron significativamente diferentes para todos los análisis.

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Resultados

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La evaluación preclínica de los efectos de las nuevas inmunoterapias y combinaciones en el cáncer de vejiga requiere el desarrollo de un modelo animal adecuado. En nuestro modelo de ratón transgénico, la inducción con el carcinógeno químico OH-BBN dio lugar a una alta tasa de incidencia del cáncer de vejiga predominantemente de TCC con un poco de SCC, que es similar al cáncer de vejiga en humanos. Para determinar la histología del tumor, el estado MUC1 expresión y la respuesta inmune a la vacuna de péptido de tratamient...

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Discusión

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La inducción exitosa de carcinoma de células transicionales de vejiga y de células escamosas invasivo en ratones MUC1.Tg humanos ofrece un modelo preclínico para el desarrollo de la inmunoterapia. Estudios inmunoterapéuticas requieren el uso de un modelo intacta espontánea, inmunológico con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria a la progresión del tumor con el tiempo, así como la respuesta inmune a la inmunoterapia. En un modelo desarrollo de tumores espontáneo, el microambiente tumoral se mantiene intacto y los t...

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Divulgaciones

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DPV, MMA, SMG, CJK, AMG y GKH no declarar los intereses en conflicto. MWD es el investigador principal de la subvención recibida de Merck KGaA y MW es un empleado de Merck KGaA.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer al Programa de Biología de la Universidad de California Davis ratón para la cría de los ratones. Esta investigación fue apoyada por una donación de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
 
N-butil-N-(4-hidroxibutil)-nitrosamina (OH-BBN)TCI AmericaB0938
20 G Agujas de sonda nasogástricaPopper Sons, Inc.7921Acero inoxidable
Vacuna peptídicaN/AN/A Agenteen investigación
BD MicrotainersBD365957
Casetes de tejidoSimportM490-12
Formalina tamponada neutra al 10%Fisher ScientificSF100-4
Tampón de lisisPierce87787
Halt Proteasa & Cóctel de inhibidores de fosfatasaThermo Scientific78444
Pierce BCA Protein Assay KitPierce23225
Mouse Cytokine 20plex KitInvitrogenLMC006
Microesferas Magnéticas PerlasLuminexMC100xx-01xx es la región del perla
Anti-ratón TNF- Anticuerpo de capturaBD Pharmingen551225
Anti-ratón TNF- Anticuerpo de detecciónBD Pharmingen 554415
Anti-ratón IFN- Anticuerpo de capturaAbcamab10742
Anti-ratón IFN- Anticuerpo de detecciónAbcamab83136
PBS, pH 7.4SigmaP3813-10PAK
Tween-20FisherBP337-500
Tampón de ensayoMilliporeL-MAB
Citoquina EstándarMilliporeMXM8070
Placas filtrantes multipantalla HTS de 96 pocillosMilliporeMSBVN1210
SA-PEInvitrogenSA10044
100 m Tamices de tejido de nailonBD352360 BD 352360
Medios de separación de esplenocitosLonza17-829E
TNF- /IL-4 Placas ELISpotR& D SystemsELD5217
Conejo Anticuerpo monoclonal anti-MUC1Epítomics2900-1
Cabra Anticuerpo monoclonal anti-actinaSigmaA1978
Anticuerpo HRP anti-conejoPromegaW401B
Cabra Anticuerpo HRP anti-ratónSanta Cruz Biotechnology, Inc.SC-2005
Membrana de PVDFBioRad162-0174
Mini Protean TGX Geles PrefabricadosBioRad456-1083
Muse Count & Kit de viabilidadMilliporeMCH100104
MUC1 AnticuerpoBD Pharmingen550486IHC anticuerpo
Experimentación en animales Kit de peroxidasaDakoK3954IHC tinción
Equipos y software
vacío de placaMillipore MSVMHTS00
Luminex Lx200Millipore / Luminex40-013Fabricado por Luminex, distribuido por Millipore
Luminex Xponent SoftwareMillipore / LuminexN/AVersión 3.1; incluido con Luminex Lx200
Milliple Analyst SoftwareMilliplex / VigeneTech40-086Versión 5.1
Muse Cell AnalyzerMillipore0500-3115
Muse SoftwareMilliporeN/AVersión 1.1.0.0; incluido con el analizador
Microscopio de disecciónUnitronZ730
Graphpad Prism SoftwareGraphpad Software Inc.N/AVersión 5.1
Mini Protean Tetra Cell GelBioRad165-8001
Trans Blot SD Cell y PowerPacBioRad170-3849
Millipore aparato de apparatus

Referencias

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