Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia
En este artículo
Resumen
Resumen
Un modelo preclínico de cáncer de vejiga invasivo fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) transgénicos (MUC1.Tg) ratones para el propósito de la evaluación de la inmunoterapia y / o quimioterapia citotóxica. Para inducir el cáncer de vejiga, C57BL / 6 ratones (tipo MUC1.Tg y silvestres) fueron tratados por vía oral con el carcinógeno N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / día, 5 días / semana durante 12 semanas. Para evaluar los efectos de OH-BBN en el perfil de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor, sangre total se recogió a través de hemorragias submandibulares antes del tratamiento y cada cuatro semanas. Además, una vacuna de péptido MUC1-específica y el placebo se administraron a grupos de ratones a la semana durante ocho semanas. Se realizaron Multiplex fluorométricos inmunoanálisis microperlas de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor y después de la vacunación. A la terminación, el interferón gamma (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análisis de ELISPOT para MUC1 respuesta inmune de células T específica y evaluaciones histopatológicas de tipo de tumory se realizaron grado. Los resultados mostraron que: (1) la incidencia de cáncer de vejiga en ratones de tipo salvaje tanto MUC1.Tg y fue de 67%; (2) carcinomas de células transicionales (TCC) desarrollados en la relación 2:1 en comparación con carcinomas de células escamosas (SCC) ; (3) las citoquinas inflamatorias se incrementaron con el tiempo durante el desarrollo del tumor, y (4) la administración de la vacuna de péptido induce un perfil de citoquinas Th1-polarizado suero y una respuesta de células T específica MUC1. Todos los tumores en ratones MUC1.Tg fueron positivos para la expresión de MUC1, y la mitad de todos los tumores en ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg eran invasiva. En conclusión, el uso de un enfoque de equipo a través de la coordinación de los esfuerzos de los farmacólogos, inmunólogos, anatomopatólogos y biólogos moleculares, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico intacto inmunológico del cáncer de vejiga que expresa hMUC1.
Introducción
El cáncer de vejiga es el cuarto tipo de cáncer más común y la octava causa de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses. En los Estados Unidos, se espera que unos 72.500 nuevos casos y 15.000 muertes por cáncer de vejiga entre los hombres y mujeres en conjunto en 2013 1. La incidencia de cáncer de vejiga es aproximadamente tres veces mayor en los hombres que en las mujeres. En los Estados Unidos, carcinomas de células transicionales (TCC) representan más del 90% de los casos, mientras que los carcinomas de células escamosas (SCC) tienen una incidencia de menos de 2% 2. La tasa de supervivencia a 5 años relativa global para papilar TCC es....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los estudios con animales y los experimentos se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado por la Universidad de California, Davis Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comité Consultivo administrativa.
1. MUC1.Tg ratón obtención y la reproducción
- El Programa de Biología del Ratón Davis UC (MBP) razas de tipo salvaje C57BL / 6 ratones machos con heterocigotos MUC1.Tg C57BL / 6 ratones hembra para establecer nuestra colonia. MUC1.Tg crías se entregan los estudios según sea necesario.
- Personal de MBP clip de los dedos de la descendencia en un patrón definido (0-99) para la identificación del ratón y, cuand....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La evaluación preclínica de los efectos de las nuevas inmunoterapias y combinaciones en el cáncer de vejiga requiere el desarrollo de un modelo animal adecuado. En nuestro modelo de ratón transgénico, la inducción con el carcinógeno químico OH-BBN dio lugar a una alta tasa de incidencia del cáncer de vejiga predominantemente de TCC con un poco de SCC, que es similar al cáncer de vejiga en humanos. Para determinar la histología del tumor, el estado MUC1 expresión y la respuesta inmune a la vacuna de péptido de tratamient.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La inducción exitosa de carcinoma de células transicionales de vejiga y de células escamosas invasivo en ratones MUC1.Tg humanos ofrece un modelo preclínico para el desarrollo de la inmunoterapia. Estudios inmunoterapéuticas requieren el uso de un modelo intacta espontánea, inmunológico con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria a la progresión del tumor con el tiempo, así como la respuesta inmune a la inmunoterapia. En un modelo desarrollo de tumores espontáneo, el microambiente tumoral se mantiene intacto y los t.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
DPV, MMA, SMG, CJK, AMG y GKH no declarar los intereses en conflicto. MWD es el investigador principal de la subvención recibida de Merck KGaA y MW es un empleado de Merck KGaA.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Programa de Biología de la Universidad de California Davis ratón para la cría de los ratones. Esta investigación fue apoyada por una donación de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| N-butil-N-(4-hidroxibutil)-nitrosamina (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Agujas de sonda nasogástrica | Popper Sons, Inc. | 7921 | Acero inoxidable |
| Vacuna peptídica | N/A | N/A Agente | en investigación |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Casetes de tejido | Simport | M490-12 | |
| Formalina tamponada neutra al 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Tampón de lisis | Pierce | 87787 | |
| Halt Proteasa & Cóctel de inhibidores de fosfatasa | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Microesferas Magnéticas Perlas | Luminex | MC100xx-01 | xx es la región del perla |
| Anti-ratón TNF- Anticuerpo de captura | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-ratón TNF- Anticuerpo de detección | BD Pharmingen 554415 | ||
| Anti-ratón IFN- Anticuerpo de captura | Abcam | ab10742 | |
| Anti-ratón IFN- Anticuerpo de detección | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Tampón de ensayo | Millipore | L-MAB | |
| Citoquina Estándar | Millipore | MXM8070 | |
| Placas filtrantes multipantalla HTS de 96 pocillos | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Tamices de tejido de nailon | BD | 352360 BD 352360 | |
| Medios de separación de esplenocitos | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 Placas ELISpot | R& D Systems | ELD5217 | |
| Conejo Anticuerpo monoclonal anti-MUC1 | Epítomics | 2900-1 | |
| Cabra Anticuerpo monoclonal anti-actina | Sigma | A1978 | |
| Anticuerpo HRP anti-conejo | Promega | W401B | |
| Cabra Anticuerpo HRP anti-ratón | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| Membrana de PVDF | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Geles Prefabricados | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Kit de viabilidad | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Anticuerpo | BD Pharmingen | 550486 | IHC anticuerpo |
| Experimentación en animales Kit de peroxidasa | Dako | K3954 | IHC tinción |
| Equipos y software | |||
| vacío de placa | Millipore MSVMHTS00 | ||
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Fabricado por Luminex, distribuido por Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Versión 3.1; incluido con Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Versión 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Versión 1.1.0.0; incluido con el analizador |
| Microscopio de disección | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Versión 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell y PowerPac | BioRad | 170-3849 |
Referencias
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215(2007).
- Jacobs, B. L.,....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
