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Artículo de método

La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

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DOI:

10.3791/50926

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26 de diciembre de 2013

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1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras en células eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión de esta técnica mediante el análisis de los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microentorno.

Resumen

MALDI-TOF es una técnica de espectrometría de masas ampliamente utilizada en química y bioquímica. También se ha aplicado en medicina para identificar moléculas y biomarcadores. Recientemente, se ha utilizado en microbiología para la identificación rutinaria de bacterias cultivadas a partir de muestras clínicas, sin pasos de preparación o fraccionamiento. Nosotros y otros hemos aplicado con éxito esta técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras a células eucariotas. Las aplicaciones actuales van desde la identificación de tipos de células hasta el control de calidad, la evaluación de cultivos celulares y aplicaciones de diagnóstico. Aquí, describimos su uso para explorar los diversos fenotipos de polarización de los macrófagos en respuesta a citocinas o bacterias muertas por calor. Permitió la identificación de huellas dactilares específicas de macrófagos que son representativas de la diversidad de respuestas proteómicas de los macrófagos. Esta aplicación ilustra la precisión y simplicidad del método. El protocolo que describimos aquí puede ser útil para estudiar la respuesta inmune del huésped en condiciones patológicas o puede extenderse a aplicaciones diagnósticas más amplias.

Introducción

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es una técnica popular de espectrometría de masas para estudiar muestras biológicas. El uso de un rayo láser y una matriz absorbente de energía permite un proceso de ionización suave: la evaporación y génesis de grandes biomoléculas, en su mayoría de carga única. Este proceso se denomina desorción/ionización, justificando el acrónimo MALDI. A continuación, estos iones se aceleran mediante la aplicación de voltaje y entran en un analizador TOF que permite la separación de estos iones y la cuantificación de sus respectivas masas1.

MALDI-TOF MS se ha utilizado ampliamente en biología, química y medicina para identificar moléculas y biomarcadores2-4 o para monitorear modificaciones postraduccionales en proteins5,6. Recientemente, varios grupos aplicaron MALDI-TOF MS a la identificación de microorganismos a partir de muestras clínicas7,8. En la actualidad, esta aplicación microbiológica se utiliza de forma rutinaria en los entornos clínicos. El MALDI-TOF de célula completa tiene muchas ventajas en comparación con las aplicaciones clásicas de MALDI-TOF MS. Las muestras que contienen células enteras se procesan directamente, lo que evita pasos que consumen mucho tiempo para fraccionar o separar grandes cantidades de material. Además, no es necesaria la caracterización de los distintos picos: todo el espectro se considera como una huella dactilar de la muestra, y los algoritmos de coincidencia comparan el espectro probado con una base de datos de espectros de referencia.

Nosotros y otros hemos aplicado esta técnica de análisis de células enteras a células eucariotas. De esta técnica se pueden derivar muchas aplicaciones: (1) identificar los principales tipos de células a partir de una muestra mixta9-11; (2) evaluar la viabilidad de los cultivos celulares a lo largo del tiempo (incluidas las aplicaciones industriales de control de calidad)12; (3) monitorear los estados de activación de una sola célula tipo13; (4) evaluar la transformación maligna de una muestra clínica14,15.

Aquí, describimos el uso de MALDI-TOF MS de célula entera para explorar los diversos fenotipos de polarización de los macrófagos en respuesta a citocinas o bacterias muertas por calor. Los macrófagos desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria a los patógenos microbianos. Detectan agentes infecciosos en los tejidos a través de receptores de reconocimiento de patrones capaces de detectar patrones microbianos conservados, como el lipopolisacárido (LPS)16. Los macrófagos son células presentadoras de antígenos profesionales que interactúan con las células T para montar la respuesta inmunitaria adaptativa. Las células T influyen en los macrófagos mediante la liberación de citocinas que refuerzan o regulan la actividad microbicida de los macrófagos. Por analogía con la polarización de linfocitos Th1/Th2, los macrófagos inflamatorios, microbicidas y tumoricidas se han clasificado en macrófagos M1 y macrófagos inmunorreguladores como macrófagos M217-19. El término M1 se refiere a la activación clásica de los macrófagos por citocinas de tipo I, como el interferón (IFN)-γ y el factor de necrosis tumoral (TNF), o productos bacterianos, como el LPS18,20-23, mientras que los macrófagos activados por vías alternativas (interleucina (IL)-4, IL-10, Factor de Crecimiento Transformante-β1 se consideran macrófagos M219,24,25. La alta plasticidad fenotípica y funcional de los macrófagos en respuesta a su microambiente hace que estos macrófagos sean útiles para analizar cambios sutiles mediante un enfoque MALDI-TOF MS.

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Protocolo

En el presente protocolo, se utiliza la técnica MALDI-TOF de célula entera para obtener un espectro de masas considerado como una huella dactilar de la muestra. Un análisis bioinformático permitió la comparación y clasificación de estas huellas dactilares. Había tres partes principales en este protocolo:

  1. La preparación de las muestras biológicas: control de macrófagos y macrófagos estimulados con diferentes agonistas.
  2. El análisis de cada tipo de muestra con réplicas técnicas mediante MALDI-TOF MS de célula entera.
  3. El análisis bioinformático de los datos brutos.

Prepare soluciones estériles para el aislamiento y cultivo celular. Prepare y almacene todos los reactivos a 4 °C

1. Preparación de monocitos humanos

  1. Preparar el medio de cultivo celular. Añadir 55 ml de suero humano AB+ o suero fetal bovino (FBS) y 5 ml de la solución antibiótica (penicilina a 10.000 UI/ml y estreptomicina a 10.000 μg/ml; concentración final de 100 UI/ml para la penicilina y 100 μg/ml para la estreptomicina) al medio RPMI 1640 (500 ml).
    1. Aísle células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucopacks (concentrados de leucocitos).
      1. Prepare tubos de 50 ml que contengan 15 ml de Ficoll. Diluir la sangre en solución salina (vol/vol, 1/10). Deposite 30 ml de PBMC diluidos en Ficoll como se describió anteriormente26.
      2. Centrífuga a 700 x g durante 20 min. Recuperar PBMCs en la interfaz entre Ficoll (densidad de 1,077 g/ml) y plasma diluido. Diluir las PBMC en medio de cultivo y centrifugar a 300 x g durante 5 min.
    2. Prepare monocitos CD14+ a partir de PBMC utilizando perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD14.
      Nota: Mantener los productos y las células a 4 °C hasta la obtención del monocito.
      1. Prepare un tampón de funcionamiento compuesto por solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2, albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM.
      2. Disocie suavemente las PBMC granuladas (10a 7 células por ensayo) en 80 μl de tampón corriente.
      3. Agregue 20 μl de MicroBeads CD14 a las PBMC. Mezcle e incube las PBMC durante 15 minutos. Lave las PBMC con 5 ml de tampón corriente y centrifugue a 300 x g durante 5 min. Disocie suavemente las PBMC peletizadas en 500 μl de tampón de funcionamiento para 108 PBMC.
        Nota: utilice 500 μl de tampón de funcionamiento para concentraciones de PBMC inferiores a 108 PBMC.
      4. Proceda a la separación magnética.
        Nota: para menos de 2 x 108 PBMC, use la columna MS; para más de 2 x 108 PBMC y menos de 2 x 109 PBMC, use la columna LS.
      5. Enjuague la precolumna y la columna con tampón de funcionamiento (500 μl para la columna MS o 3 ml para la columna LS).Agregue PBMC en la precolumna (espere a que las celdas sin etiquetar pasen a través de la columna). Enjuague 3 veces con tampón de ejecución (500 μl para la columna MS o 3 ml para la columna LS). Retire la precolumna.
      6. Coloque la columna en tubos de 15 ml. Añada tampón de ejecución (1 ml para la columna MS o 5 ml para la columna LS) en la columna y eluya las células CD14+ aplicando una presión sobre la columna.
      7. Centrifugar el eluido a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Lave el pellet de monocitos con 10 ml de medio de cultivo.
        Nota: Analice la pureza de la preparación de monocitos utilizando anticuerpos anti-CD14 y citometría de flujo (clásicamente superior al 95%).
  2. Diferenciación de monocitos en macrófagos.
    1. Incubar los monocitos (10,6 monocitos por pocillo en placas de 6 pocillos) en 3 ml de medio de cultivo que contenga un 10% de suero humano AB+ a 37 °C. Después de 4 días, reemplace el medio de cultivo que contiene suero humano por 3 ml de medio de cultivo que contenga 10% de FBS durante 3 días adicionales.
    2. Identifique la población celular obtenida como macrófagos derivados de monocitos (MDM) mediante citometría de flujo (ver Figura 1).
      1. Sustituya el medio de cultivo por 3 ml de PBS. Raspe los MDM con un policía de goma y recoja las suspensiones de MDM. Centrifugar a 400 x g durante 5 min. Agregue PBS que contenga un 2% de BSA a los MDM granulados y agite suavemente la suspensión celular. Ajustar la concentración celular (106 MDMs en 200 ml de PBS) e incubar a 4 °C.
      2. Añadir 10 ml de anticuerpos anti-CD14 y 10 ml de anticuerpos anti-CD68 a la suspensión de MDM e incubar a 4 °C durante 20 min en la oscuridad.
        Nota: estos anticuerpos deben marcarse con dos fluorocromos diferentes de acuerdo con el análisis de citometría de flujo. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD14 se pueden conjugar con ficoeritrina acoplada (para la tinción de monocitos) y anticuerpos anti-CD68 con Alexa Fluor 647 acoplado (para la tinción de macrófagos).
      3. Centrifugar los MDM a 400 x g durante 5 min. Eliminar los sobrenadantes. Disociar suavemente el gránulo de celda e incubar los MDM en 250 ml de paraformaldehído (PFA) al 3% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar MDM fijados con PFA a 400 x g durante 5 min. Lave los MDM con 3 ml de PBS y centrifugue los MDM a 400 x g durante 5 min. Disociar suavemente el pellet de MDM en 400 ml de PBS.
      4. Analizar la diferenciación de monocitos (que expresan CD14 pero no CD68) en monocitos (que expresan CD68 pero no CD14). Nota: clásicamente, más del 95% de las células son MDM.
  3. Estimulación de MDMs durante 18 horas.
    1. Reemplace el medio de cultivo de los MDM adheridos por un medio de cultivo fresco de 3 ml (que contenga 10% de FBS).
    2. Para inducir una polarización M1 o M2, utilice las siguientes citocinas recombinantes humanas: IFN-γ y TNF para la polarización M1, e IL-4 para la polarización M2. Los macrófagos M1 también se obtienen por estimulación con LPS. Obsérvese que las soluciones madre de citocinas se conservan a -80 °C y que la solución madre de LPS se conserva a -20 °C.
      1. Diluir la solución madre de IFN-gγ (1 mg/ml) a 1/100 en medio de cultivo para obtener una dilución de 10 ng/ml. Añadir 6 μl de esta dilución de IFN-γ a los MDM para obtener una concentración final de IFN-γ de 20 ng/ml.
      2. Diluir la solución madre de TNF (1 mg/ml) a 1/100 en medio de cultivo para obtener una dilución de 10 ng/ml. Añadir 6 μl de esta dilución de TNF a los MDM para obtener una concentración final de TNF de 20 ng/ml.
      3. Diluir la solución madre de IL-4 (1 mg/ml) a 1/100 en medio de cultivo para obtener una dilución de 10 ng/ml. Añadir 6 μl de esta dilución de IL-4 a los MDM para obtener una concentración final de IL-4 de 20 ng/ml.
      4. Añadir 3 μl de la solución madre de LPS (1 mg/ml) a los MDM para obtener una concentración final de LPS de 1 μg/ml.
    3. Para estimular los MDM con bacterias, use bacterias muertas por calor. Lave las bacterias vivas con PBS y caliéntelas a 95 °C durante 1 hora. El uso de Orientia tsutsugamushi (cepa Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP cepa 671203) y Coxiella burnetii (Nine Mile en fase I) se debió a que se sabe que estos patógenos infectan a los macrófagos. Por lo tanto, prepare una suspensión de O. tsutsugamushi a 109 bacterias/ml. Agregue 50 μl a los MDM. Repita el mismo paso para M. bovis y C. burnetii.
  4. Preparación de muestras biológicas para MALDI-TOF MS.
    1. Lave los MDM estimulados con PBS sin Ca2+ o Mg2+ (las células pueden aglutinarse en presencia de Ca2+ o Mg2+). Raspe los MDM con un policía de goma y recoja las suspensiones de MDM. Lave de nuevo los MDM en PBS sin Ca2+ o Mg2+ a 400 x g durante 5 minutos para descartar la contaminación por FBS.
    2. Ajuste la concentración de células (2 x 106 MDM por ensayo). Centrifugar los MDM a 400 x g durante 5 min y desechar los sobrenadantes. Recoja los gránulos celulares en 20 μl de PBS sin Ca2+ o Mg2+.
    3. Analice las muestras inmediatamente o guárdelas en PBS a -80 °C antes del análisis.

2. Análisis de macrófagos por MS Maldi-TOF de células enteras

  1. Elaboración de matriz CHCA.
    1. Agregue 500 μl de acetonitrilo, 250 μl de ácido trifluoroacético al 10% y 250 μl de agua de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) a un vial. Diluya 10 mg de CHCA en esta solución hasta una concentración final de 10 mg/ml. Mezclar y sonicar durante al menos 20 min.
      Nota: la sonicación mejorará la saturación de la matriz, pero este paso no es obligatorio.
    2. Centrifugar a 13.000 x g durante 5 min. Deseche el pellet y conserve el sobrenadante.
      Nota: prepare la solución de matriz justo antes de usarla. Una solución de matriz que contiene cristales no permite una buena ionización de las moléculas de la muestra, y esto puede afectar la calidad de los espectros.
  2. Preparación de la diana de acero MALDI.
    1. Humedezca el objetivo de acero pulido con agua caliente del grifo. Frote con papel de limpieza de precisión. Agregue etanol al 70% y frote. Enjuague con agua frotando. Agregue etanol al 70% y frote con papel de precisión.
    2. Sumerja el objetivo en etanol al 70% y soniquelo durante al menos 15 min. Cubra el objetivo con 500 μl a 1 ml de ácido trifluoroacético al 80%. Frote y limpie con papel de precisión. Enjuague con agua HPLC sin frotar. Seque el objetivo a temperatura ambiente.
      Nota: un objetivo mal limpiado puede afectar a la calidad de los espectros.
  3. Preparación de depósitos.
    1. Coloque el objetivo limpio sobre un soporte horizontal y nivelado para obtener depósitos uniformes.
    2. Descongele suavemente las muestras de MDM en hielo. Nota: una descongelación rápida y vigorosa puede alterar las muestras, afectando así a la calidad de los espectros. Homogeneizar los MDM (pipeteando hacia adelante y hacia atrás la suspensión celular) antes de la deposición de 1 μl (que contiene aproximadamente 1 x 105 células) en el objetivo MALDI. Añadir 1 μl de la solución de matriz MALDI en la muestra. Evite mezclar la mancha con la pipeta. La mezcla de puntos con pipetas altera la calidad de los espectros. Deponer 12-16 muestras/ensayo (réplicas técnicas).
    3. Se evapora espontáneamente a temperatura ambiente. Nota: la evaporación tiene lugar gradualmente y conduce a la formación de cristales de matriz/muestra. Los depósitos pueden analizarse inmediatamente o almacenarse en la oscuridad durante varios días antes del análisis (hasta 2 semanas).
    4. El usuario debe controlar que las citocinas o bacterias muertas por calor utilizadas en el experimento no proporcionen picos dentro del rango de espectros de los macrófagos estimulados. Aquí, comprobamos que las citocinas y las bacterias muertas por calor por sí solas no proporcionaban ninguna señal dentro del rango estudiado (0-20 kDa).
  4. Ajuste de espectrómetro de masas y adquisición de datos.
    1. Inserte el objetivo de acero que contiene muestras en el espectrómetro de masas.
    2. Configure el espectrómetro de masas y ejecute la adquisición de datos. Utilice la configuración predeterminada para la adquisición automatizada de los datos.
    3. Nota: en el apéndice/Tabla 1 se ofrece una visión detallada de la configuración del software flexControl. Esto puede variar según el espectrómetro de masas y el software utilizado.

3. Análisis bioinformático

Nota: el análisis bioinformático se realizó utilizando el software de análisis estadístico libre y de código abierto R, junto con bibliotecas de análisis específicas (MALDIquant). R se puede descargar gratuitamente desde su sitio web http://cran.r-project.org/. Se proporciona una descripción detallada del guión como material complementario.

  1. Carga y pretratamiento de datos brutos.
    1. Almacene los datos sin procesar en el equipo asociado con el espectrómetro de masas en varios archivos y carpetas. Recupere la carpeta raíz del experimento con todas las subcarpetas. Copie la carpeta raíz en la computadora personal para su análisis.
    2. Utilice las bibliotecas readBrukerFlexData y MALDIquant para cargar y analizar datos sin procesar.
      Nota: readBrukerFlexData permite la carga de datos sin procesar del espectrómetro de masas en un objeto específico en R para su posterior análisis. Para más información, véase la descripción de MALDIquant 27.
    3. Analice los espectros generados.
      Nota: cada espectro consta de una lista de picos con sus respectivas masas e intensidades (abundancia relativa). Utilice la raíz cuadrada de las intensidades para mejorar la visualización gráfica de los espectros. Corrija el fondo utilizando un algoritmo de recorte de picos no lineal sensible a estadísticas para la estimación de la línea base27. Utilice una relación señal-ruido de 6 para detectar picos. Tenga en cuenta que los picos detectados son similares en todos los espectros cuando los valores de masa/carga (m/z) están dentro de una ventana de 2.000 ppm.
  2. Definición y cálculo de puntuaciones. Clasifique los espectros utilizando un agrupamiento jerárquico con un algoritmo de barrio para la aglomeración y una matriz de disimilitud basada en la distancia de Jaccard.
    Nota: el índice de Jaccard mide la similitud entre conjuntos de muestras booleanas (es decir, la presencia/ausencia de una lista de picos).
  3. Comparación de espectros y visualización.
    1. Analice gráficos de espectros sin procesar. Nota: el eje x representa la relación m/z (en Daltons) y el eje y representa la intensidad (abundancia relativa).
    2. Evaluar la similitud entre espectros mediante agrupamiento jerárquico. Representa la similitud (o divergencia) como dendrograma.
    3. Evaluar la reproducibilidad mediante la representación virtual en gel-view. Nota: la representación virtual de vista gel es un gráfico de mapa de calor modificado donde la abundancia relativa está codificada por colores con intensidades crecientes de azul.

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Resultados

El objetivo del presente protocolo es demostrar la precisión de la MALDI-TOF MS de células completas para evaluar la respuesta de los macrófagos a su microambiente.

Figura 1 describe la preparación de macrófagos estimulados a partir de muestras de sangre. Figura 2 representa el análisis de monocitos y MDM mediante citometría de flujo. Obsérvese que los monocitos expresaron CD14 pero no CD68 (Figura 1A). Por el contrario, los MDM expresaron CD6...

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Discusión

Este protocolo describe el uso de MALDI-TOF-MS en células enteras eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión del método analizando los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microambiente.

El éxito del protocolo depende de pocos pasos críticos. Primero, cualquier contaminante de solución puede alterar los espectros. Por ejemplo, es importante lavar las células en PBS para eliminar el medio de cultivo y las proteínas séricas antes de depositarlas en el objetivo. Tamb...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar. RO, JLM y CC son inventores de una patente internacional WO 2011/154650, denominada "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Agradecimientos

Richard Ouedraogo cuenta con el apoyo de una beca del Ministère de la Santé (PHRC 2010). Agradecemos a Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops y Nicolas Amstrong por su asistencia técnica.

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