La espectrometría de masas MALDI-TOF de célula completa es un método preciso y rápido para analizar diferentes modos de activación de macrófagos

Resumen

Este protocolo describe el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras en células eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión de esta técnica mediante el análisis de los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microentorno.

Resumen

MALDI-TOF es una técnica de espectrometría de masas ampliamente utilizada en química y bioquímica. También se ha aplicado en medicina para identificar moléculas y biomarcadores. Recientemente, se ha utilizado en microbiología para la identificación rutinaria de bacterias cultivadas a partir de muestras clínicas, sin pasos de preparación o fraccionamiento. Nosotros y otros hemos aplicado con éxito esta técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF de células enteras a células eucariotas. Las aplicaciones actuales van desde la identificación de tipos de células hasta el control de calidad, la evaluación de cultivos celulares y aplicaciones de diagnóstico. Aquí, describimos su uso para explorar los diversos fenotipos de polarización de los macrófagos en respuesta a citocinas o bacterias muertas por calor. Permitió la identificación de huellas dactilares específicas de macrófagos que son representativas de la diversidad de respuestas proteómicas de los macrófagos. Esta aplicación ilustra la precisión y simplicidad del método. El protocolo que describimos aquí puede ser útil para estudiar la respuesta inmune del huésped en condiciones patológicas o puede extenderse a aplicaciones diagnósticas más amplias.

Introducción

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es una técnica popular de espectrometría de masas para estudiar muestras biológicas. El uso de un rayo láser y una matriz absorbente de energía permite un proceso de ionización suave: la evaporación y génesis de grandes biomoléculas, en su mayoría de carga única. Este proceso se denomina desorción/ionización, justificando el acrónimo MALDI. A continuación, estos iones se aceleran mediante la aplicación de voltaje y entran en un analizador TOF que permite la separación de estos iones y la cuantificación de sus respectivas masas¹.

Protocolo

En el presente protocolo, se utiliza la técnica MALDI-TOF de célula entera para obtener un espectro de masas considerado como una huella dactilar de la muestra. Un análisis bioinformático permitió la comparación y clasificación de estas huellas dactilares. Había tres partes principales en este protocolo:

1. La preparación de las muestras biológicas: control de macrófagos y macrófagos estimulados con diferentes agonistas.
2. El análisis de cada tipo de muestra con réplicas técnicas mediante MALDI-TOF MS de célula entera.
3. El análisis bioinformático de los datos brutos.

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Resultados

El objetivo del presente protocolo es demostrar la precisión de la MALDI-TOF MS de células completas para evaluar la respuesta de los macrófagos a su microambiente.

Figura 1 describe la preparación de macrófagos estimulados a partir de muestras de sangre. Figura 2 representa el análisis de monocitos y MDM mediante citometría de flujo. Obsérvese que los monocitos expresaron CD14 pero no CD68 (Figura 1A). Por el contrario, los MDM expresaron CD6.......

Discusión

Este protocolo describe el uso de MALDI-TOF-MS en células enteras eucariotas. Aquí, ilustramos la precisión del método analizando los múltiples estados de activación de los macrófagos en respuesta a su microambiente.

El éxito del protocolo depende de pocos pasos críticos. Primero, cualquier contaminante de solución puede alterar los espectros. Por ejemplo, es importante lavar las células en PBS para eliminar el medio de cultivo y las proteínas séricas antes de depositarlas en el objetivo. Tamb.......