Artículo de método

Análisis cuantitativo y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino

DOI:

10.3791/50933

⸱

7 de diciembre de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Thrombosis and Atherosclerosis Research Institute, McMaster University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos procedimientos para cuantificar y caracterizar lesiones ateroscleróticas en modelos de ratón utilizando el corte de precisión del seno aórtico y la aorta ascendente combinado con análisis histoquímico e inmunohistoquímico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aterosclerosis es una enfermedad de las grandes arterias y una de las principales causas subyacentes de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Se han desarrollado varios modelos murinos diferentes para facilitar el estudio de la fisiopatología molecular y celular de esta enfermedad. En este manuscrito describimos técnicas específicas para la cuantificación y caracterización de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico murino y la aorta ascendente. La ventaja de este procedimiento es que proporciona una medición precisa del área de la sección transversal y el volumen total de la lesión, que se puede utilizar para comparar la progresión aterosclerótica en diferentes grupos de tratamiento. Esto es posible mediante el uso de las valvas de la válvula como punto de referencia anatómico, junto con un ajuste cuidadoso del ángulo de sección. También describimos los métodos básicos de tinción que se pueden utilizar para comenzar a caracterizar la progresión aterosclerótica. Estos pueden modificarse aún más para investigar antígenos de interés específico para el investigador. Las técnicas descritas son generalmente aplicables a una amplia variedad de modelos dietéticos y genéticamente inducidos de aterogénesis existentes y de nueva creación.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En las últimas dos décadas, el desarrollo y el uso de modelos de ratón propensos a la aterosclerosis a través de la manipulación dietética y/o genética han aumentado significativamente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares y celulares implicados en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas1-3. Gran parte de nuestro conocimiento y comprensión de la aterogénesis proviene de estudios realizados en ratones con deficiencia de apolipoproteína (Apo)-E4 ratones, en los que se desarrollan espontáneamente lesiones ateroscleróticas y deficientes en receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDLR)5 ratones, en los que la aterosclerosis es inducida por la dieta. Una ventaja importante de estos modelos es que permiten el estudio de un número relativamente grande de animales genéticamente definidos en condiciones dietéticas y ambientales controladas. Además, las lesiones ateroscleróticas avanzadas que se desarrollan en algunas de estas cepas de ratones parecen ser muy similares a las observadas en sujetos humanos, conteniendo núcleos necróticos llenos de lípidos y casquetes fibrosos. La aterosclerosis se desarrolla rápidamente en estos modelos de ratón, por lo que es muy factible estudiar el desarrollo de las lesiones, desde la raya grasa hasta la placa avanzada, en cuestión de semanas. Además, se ha demostrado que los factores de riesgo conocidos para las enfermedades cardiovasculares en los seres humanos, como la diabetes6, la dislipidemia7, la obesidad8, la hipertensión9, el humo del cigarrillo10 y el sedentarismo11, aceleran aún más el desarrollo de lesiones.

En la mayoría de los modelos de ratón propensos a la aterosclerosis, si no en todos, el desarrollo de lesiones puede detectarse primero en el seno aórtico. El momento de inicio depende de la cepa del ratón y de la dieta. A medida que las lesiones aumentan de tamaño, tienden a crecer hasta la aorta ascendente. En ratones ApoE-/- y LDLR-/-, se puede detectar el desarrollo posterior de lesiones en bifurcaciones aórticas en el arco aórtico, en la aorta descendente y en otras arterias mayores12-14. La doctora Beverly Paigen y sus colegas, además de desarrollar algunos de los primeros modelos de aterosclerosis inducida por la dieta, también establecieron un ensayo para la cuantificación de lesiones ateroscleróticas en el seno aórtico que se ha convertido en el estándar de medición de lesiones en modelos de ratón15. A lo largo de los años, esta técnica ha sido refinada y descrita en detalle16. Aquí presentamos una versión modificada del "método de Paigen" para la cuantificación y caracterización de lesiones ateroscleróticas en un ratón. El análisis de cortes transversales aórticos seriados de una región vascular específica y en una orientación definida y fija, facilita la recopilación precisa de datos y permite la detección precisa de variaciones en el desarrollo de lesiones en diferentes grupos de tratamiento. Los métodos presentados aquí se basan en las técnicas anteriores. Específicamente, describimos cómo la caracterización de la lesión en términos de área, volumen, necrótico y contenido celular es posible a través del examen de secciones seriadas utilizando una combinación de histoquímica e inmunohistoquímica.

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Protocolo

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La Junta de Ética de Investigación Animal de la Universidad McMaster ha aprobado previamente todos los procedimientos descritos en este documento.

1. Cosechando corazón y aorta

  1. Anestesia al ratón y abre cuidadosamente la cavidad torácica para revelar el corazón y la aorta proximal.
    1. Extraiga la sangre del ratón mediante punción directa del ventrículo derecho del corazón.
      Nota: La sangre puede almacenarse y utilizarse para el análisis de lípidos plasmáticos y otros factores transmitidos por la sangre.
  2. Eutanasia del ratón por luxación cervical.
  3. Enjuague la vasculatura con 5 ml de solución salina.
    Nota: Esto se logra mediante perfusión por gravedad a través de una punción con aguja en el ventrículo izquierdo. Para permitir el drenaje, se realiza una pequeña incisión en la aurícula derecha. Después de enjuagar la vasculatura, se pueden recoger muestras de tejido hepático, muscular y adiposo, congelarlas rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 ºC para su posterior análisis.
  4. La vasculatura se fija por perfusión por gravedad en el ventrículo izquierdo con un 10% de formalina tamponada neutra.
    Nota: Una vez iniciada la perfusión, el flujo de formalina tamponada neutra al 10% se ajusta a un goteo lento para que el proceso dure 1-2 minutos. Los órganos y tejidos que han sido fijados por perfusión se pueden utilizar para el estudio de la expresión de proteínas a través de la inmunofluorescencia o la histoquímica, pero generalmente no se pueden utilizar como muestras para la transferencia de Western o para el estudio de la expresión génica.
  5. Extraiga cuidadosamente el corazón y aproximadamente 2 mm de aorta proximal de la canal. Otros tejidos, incluida la aorta descendente, pueden recogerse y almacenarse para su posterior análisis.
    Nota: La aorta descendente (a la bifurcación ilíaca) también se puede utilizar para examinar la aterosclerosis.
  6. Realizar una incisión transversal con bisturí sobre el corazón extraído de forma perpendicular a la aorta ascendente.
    Nota: Esto se facilita con el uso de un microscopio de disección y se puede hacer eficazmente cortando a lo largo de una línea recta que une las puntas inferiores de las aurículas derecha e izquierda (Figura 1).
  7. Guarde la parte apical (superior) del corazón en un casete de inclusión y sumérjalo en formol neutro tamponado para su procesamiento.

2. Preparación de la aorta

  1. Coloque el casete con el tejido diseccionado en el procesador de tejidos.
  2. Procesar muestras de tejido.
    Nota: Generalmente, los procesadores de tejidos están programados para trabajar durante la noche debido a la duración de la operación y las soluciones involucradas en este proceso. Las muestras se procesan siguiendo un protocolo establecido:
    1. 10% de formol neutro tamponado durante 1 h a 42 ºC.
    2. 10% de formol neutro tamponado durante 1 h a 42 ºC.
    3. Etanol al 70% durante 30 min a 40 ºC.
    4. Etanol al 85% durante 30 min a 40 ºC.
    5. Etanol 100% durante 45 min a 40 ºC.
    6. Etanol 100% durante 45 min a 40 ºC.
    7. Etanol 100% durante 45 min a 40 ºC.
    8. Xileno durante 1 h a 40 ºC.
    9. Xileno durante 1 h a 40 ºC.
    10. Xileno durante 1 h a 40 ºC.
    11. Cera de parafina durante 45 min a 63 ºC.
    12. Cera de parafina durante 45 min a 63 ºC.
    13. Cera de parafina durante 45 min a 63 ºC.
    14. Cera de parafina durante 45 min a 63 ºC.
  3. Derretir la cera de parafina durante la noche a 62 ºC (Figuras 1D-E). Calcule la cantidad total de cera de parafina que se utilizará en función de los gramos de cera de parafina necesarios para llenar un molde de histología y el número de bloques que se preparar><án. Nota: Se prefiere un molde de histología profunda a un molde poco profundo porque proporciona un ángulo de rotación potencial más amplio al seccionar. Un solo molde de histología profunda requiere 11 g de cera de parafina.
  4. Coloque cada tejido procesado en un molde de histología profunda y luego vierta cera de parafina derretida para llenar completamente el molde (Figura 1F). Cubra el molde con un casete de plástico etiquetado (Figura 1G).
  5. Enfríe el molde lleno con hielo, o sobre una superficie fría (Figura 1H), para crear el bloque sólido y separar el bloque del molde (Figuras 1I-J).
    Nota: Al colocar el corazón diseccionado en el molde, asegúrese de que la cara interna del corazón toque la base del molde y luego proceda a llenar el bloque con parafina derretida. Un casete de plástico etiquetado cubre el molde antes de que se solidifique para proporcionar una base para manejar el bloque. Una vez enfriado, se retira el molde y los bloques de parafina se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente.

3. Seccionamiento de la aorta

  1. Coloque el bloque con el corazón en el portamuestras del micrótomo de manera que pueda seccionarse desde el interior hacia la parte superior del corazón (Figura 2)
  2. Ajuste el micrótomo para cortar un grosor de sección de 10 μm y proceda a seccionar el corazón.
  3. Recoja secciones en un portaobjetos de vidrio y examínelas bajo un microscopio óptico para determinar la posición y la orientación.
  4. Cuando se hagan evidentes 1 o 2 válvulas del seno aórtico, ajuste el ángulo del bloqueo según sea necesario (Figura 3A)
    Nota: Los senos paranasales deben aparecer como tres bases valvulares bipartitas con valvas adjuntas. Si solo se observan una o dos valvas de válvulas, el ángulo de corte debe ajustarse en consecuencia.
  5. Ajuste el micrótomo para cortar a 4-5 μm y recoja las secciones en portaobjetos de vidrio recubierto.
    Nota: Aunque el procedimiento puede variar, se recomienda un enfoque sistemático, mediante el cual las primeras 10 secciones, desde el seno aórtico que avanza por la aorta ascendente, se recogen en la parte superior de un portaobjetos de vidrio etiquetado (portaobjetos etiquetados 1-10). Las secciones posteriores se recogen siguiendo el mismo patrón: #11-20, #21-30, #31-40 hasta que ya no se observan las lesiones ateroscleróticas (Figura 3B). De esta manera, las lesiones ateroscleróticas pueden examinarse y caracterizarse en ubicaciones precisas a lo largo de la aorta ascendente. Por ejemplo, la diapositiva 1 contiene las secciones 1, 11, 21, 31, 41 y 51, que representan lesiones ateroscleróticas desde el seno aórtico hasta la aorta ascendente. Se pueden incluir láminas adicionales, etiquetadas como 11-20, si la lesión es grande, para recoger más secciones distales siguiendo el mismo patrón.
  6. Continúe recolectando secciones hasta que no se observe ninguna lesión aterosclerótica.
    Nota: Los portaobjetos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante meses, antes de su posterior análisis.

4. Tinción y cuantificación de lesiones ateroscleróticas

Las lesiones ateroscleróticas se pueden analizar de muchas maneras diferentes utilizando una variedad de técnicas. El análisis más básico consiste en la determinación del área de la sección transversal de la lesión. Para comparar con precisión el área de la lesión, es importante que el punto de partida para la medición de la lesión sea consistente de una muestra a otra. Esto se facilita mediante el uso de las valvas de la válvula para la orientación. Para facilitar la identificación y cuantificación precisas del área de la lesión, secciones transversales seleccionadas se tiñen con hematoxilina y eosina. Esto implica sumergir los portaobjetos en una serie de soluciones durante tiempos específicos, que desparafinarán / teñirán el tejido.

Protocolo para la tinción de hematoxilina y eosina:

  1. Coloque los portaobjetos en el secador de aire durante 8 minutos y luego desparafine las secciones lavando 4× en xileno, durante 3 minutos por lavado.
  2. Lave los portaobjetos en etanol 100% 3× durante 3 minutos cada uno.
  3. Lave 3× en etanol al 70% durante 3 minutos cada uno y luego 2× en etanol al 50% durante 3 minutos cada uno.
  4. Enjuague con agua destilada y luego sumerja en Hematoxilina de Mayer durante 15 min.
  5. Lavar con agua corriente del grifo durante 5 minutos y luego lavar con agua destilada durante 5 minutos.
  6. Sumergir en Eosin Y durante 1-5 min.
  7. Lavar en agua destilada 3× durante 5 minutos cada uno, lavar en etanol al 50% 2× durante 2 minutos cada uno, luego etanol al 70% 3× durante 2 minutos cada uno.
  8. Lavar en etanol al 100% 3× durante 2 minutos cada uno y luego lavar en xileno al 4× durante 2 minutos cada uno.
  9. Monte las secciones con un medio de montaje a base de xileno y capture imágenes con una cámara digital montada en un microscopio óptico.
  10. Identifique y cuantifique el área de la lesión utilizando software de imagen.
    Nota: El área de la lesión se puede determinar a distancias específicas del seno aórtico a intervalos de 40-50 μm (dependiendo del grosor de cada sección). Un gráfico de estas medidas de área frente a distancia da un perfil de la lesión aterosclerótica (Figura 4). El área bajo la curva representa una estimación del volumen total de la lesión aterosclerótica. La caracterización adicional de la lesión puede incluir la determinación del área necrótica. El núcleo necrótico (nc) de una lesión avanzada está formado por células espumosas apoptóticas. Con la práctica, esto puede determinarse mediante el examen de las regiones acelulares de las secciones teñidas con hematoxilina y eosina (Figura 4A). Las lesiones tempranas tienden a tener muy poca necrosis, mientras que las lesiones más avanzadas tienen áreas necróticas aumentadas que pueden contribuir a la inestabilidad de la placa. Se deben examinar secciones seriadas de la misma aorta para confirmar la presencia de una región necrótica.

5. Caracterización adicional de la lesión aterosclerótica

Los detalles específicos sobre la etapa del desarrollo aterosclerótico se pueden determinar mediante tinción con anticuerpos dirigidos contra tipos de células o marcadores específicos. La inmunohistoquímica en secciones de parafina es una técnica estándar que se utiliza para identificar tipos específicos de células o marcadores dentro del contexto del tejido circundante no teñido. La detección de antígenos generalmente se logra utilizando un sustrato de peroxidasa de rábano picante.

La tinción de inmunofluorescencia implica el uso de anticuerpos conjugados con fluoróforos y requiere un microscopio de fluorescencia y filtros adecuados para su detección. Esta técnica permite la tinción simultánea de dos (o más) antígenos.

Protocolo general para la tinción inmunohistoquímica:

  1. Coloque los portaobjetos en el secador de aire durante 8 min.
  2. Desparafina las secciones en 4 cambios de xileno, 3 min each.
  3. Lavar en etanol 100% 3× durante 3 minutos cada uno para eliminar el xileno.
  4. Lave 3× en etanol al 70% durante 3 minutos cada uno, luego 2× en etanol al 50% durante 3 minutos cada uno.
  5. Lavar en agua destilada 5 minutos cada uno, luego lavar 3× en PBS durante 5 minutos cada uno.
  6. Realizar la recuperación de antígenos. Esto se puede lograr utilizando el método de recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) en una olla a presión de microondas y una solución de recuperación de antígenos (tampón de citrato de 10 mM, pH 6.0).
    Nota: El proceso de fijación de formalina puede enmascarar los antígenos de interés. En nuestra experiencia, el HIER mejora significativamente el rendimiento de algunos anticuerpos, pero no es necesario para otros. Además, existen otras alternativas disponibles al método HIER de recuperación de antígenos.
  7. Cuando la olla a presión se haya enfriado, coloque los portaobjetos en PBS durante 15 minutos.
  8. Incubar secciones en suero normal (de la misma especie de la que se derivó el anticuerpo secundario) durante 30 min. NO LAVAR LOS PORTAOBJETOS: DRENE EL SUERO.
  9. Incubar con anticuerpo primario diluido en suero bloqueante normal durante 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
  10. Lavar con PBS 3× durante 5 min cada uno.
  11. Incubar secciones con el anticuerpo secundario biotinilado que se ha diluido en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.
  12. Incubar los portaobjetos con estreptavidina peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos, luego lavar con PBS 3× durante 5 minutos cada uno.
  13. Reacción cromogénica: incubar portaobjetos en DAB fresco (3,3'-diaminobenzidina) durante 5-30 min. Esta reacción debe controlarse con un microscopio. Detenga la reacción lavando los portaobjetos con agua del grifo.
  14. Contramancha con hematoxilina durante 1 min. Lavar con agua del grifo durante 5 min y luego lavar en agua destilada 3× durante 5 min cada uno.
  15. Repita los pasos 4.7-4.9 para el montaje de las correderas.

6. Protocolo general para la tinción de inmunofluorescencia

Se puede seguir un protocolo similar, con cambios menores, para la tinción de inmunofluorescencia.

  1. Coloque los portaobjetos en el secador de aire durante 8 minutos y luego desparafine las secciones en 4 cambios de xileno, de 3 minutos cada uno.
  2. Lavar en etanol 100% 3× durante 3 minutos cada uno para eliminar el xileno.
  3. Lave 3× en etanol al 70% durante 3 minutos cada uno, luego 2× en etanol al 50% durante 3 minutos cada uno.
  4. Lavar en agua destilada durante 5 minutos cada uno y luego lavar en PBS 3× durante 5 minutos cada uno.
  5. Realizar la recuperación de antígenos. Esto se puede lograr utilizando el método de recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) en una olla a presión de microondas y una solución de recuperación de antígenos (tampón de citrato de 10 mM, pH 6.0).
    Nota: El proceso de fijación de formalina puede enmascarar los antígenos de interés. En nuestra experiencia, el HIER mejora significativamente el rendimiento de algunos anticuerpos, pero no es necesario para otros. Además, existen otras alternativas disponibles al método HIER de recuperación de antígenos.
  6. Cuando la olla a presión se haya enfriado, coloque los portaobjetos en PBS durante 15 minutos.
  7. Incubar secciones en suero normal (de la misma especie de la que se derivó el anticuerpo secundario) durante 30 min. NO LAVAR LOS PORTAOBJETOS: DRENE EL SUERO.
  8. Incubar con anticuerpo primario diluido en suero bloqueante normal durante 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
  9. Lavar con PBS 3× durante 5 min cada uno.
  10. Agregue un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos que se diluye en suero bloqueante normal (o PBS). Incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
  11. Lavar con PBS 3× durante 5 min cada uno.
  12. Contrarresta la tinción con DAPI.
  13. Lavar en PBS 3× durante 5 minutos cada uno.
  14. Aplique un cubreobjetos utilizando medios de montaje antidecoloración.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

 Se alimentó a ratones LDLR-/- de cinco semanas de edad con una dieta estándar o una dieta rica en grasas durante diez semanas. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con formalina según se describió anteriormente. Se prepararon secciones transversales del seno aórtico y se tiñeron con hematoxilina y eosina para determinar el área y el volumen de la lesión (Figura 4). Cuando los ratones se alimentan con una dieta estándar, el desarrollo aterosclerótico es muy limitado y puede no ser detectabl...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aterosclerosis es una enfermedad crónica compleja de las arterias musculares grandes que es una de las principales causas subyacentes de infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. La progresión de la enfermedad implica la interacción de muchos tipos de células diferentes dentro de la pared arterial, con células sanguíneas circulantes, partículas de lipoproteínas y otros factores transmitidos por la sangre que recién estamos comenzando a comprender. Gran parte de nuestro conocimiento actual sobre el desarrollo y...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue financiada por una subvención operativa de los Institutos Canadienses de Ciencias de la Salud y la Asociación Canadiense de Diabetes. DEV cuenta con una beca de la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT, Chile).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ratones deficientes en LDLR ( D2.129S7(B6)-Ldlrtm1Her/J)laboratorio Jackson#002207
FormalinaSigma-AldrichHT5011
Moldes de histologíaTed Pella Inc27195
ParafinaParamat19286-10
Portaobjetos recubiertosFisher12-550-15
Recipientes de disolventesTissue Tek II4457
MicrotomoLeicaRM22S5
Baño de aguaVWR80086-982
MicroscopioOlympusBX41TF
CámaraOlympusDP72
ImageJNIHwww.rsbweb.nih.gov/ij/
ProcesadorSakura FinetekVIP6-A1
Casetes de procesamientoVWR18000-134
Cocina de presiónNordic Ware
CoverslipFisher12-545-M
PBSSigma-AldrichP3813
Hoja de micrótomoThermo Scientific30-518-35
Medio de montaje antidecoloraciónSigma-AldrichF-4680
Montaje de xileno medio Sigma-Aldrich44581
Medio de montaje AquousSigma-AldrichI1161
Mac-3 anbodyBD Pharmingen553322
DAPISigma-AldrichD9542
F4/80anticuerpo AbcamAb6640
Anticuerpo alfa actinaSanta Cruz BiotechnologySC-32251
Mayer’ s HematoxilinaSigma-AldrichE4382
Eosina YSigma-AldrichMHS16
DAB (3,3'-Diaminobenzidina)DakoK3468
El stock de

Referencias

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