Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

Resumen

Describimos el uso de un microscopio óptico estándar para realizar mediciones cuantitativas de masa, volumen y densidad celular a través de una combinación de imágenes de campo claro y contraste de interferencia diferencial.

Resumen

Se describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo brillante y contraste de interferencia diferencial imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y distribución de la densidad subcelular, y transformada de Hilbert diferencial microscopía de contraste de interferencia (HTDIC) para determinar el volumen. NIQPM se basa en un modelo simplificado de la propagación de ondas, llamadas a la aproximación paraxial, con tres supuestos básicos: apertura numérica baja (NA) de iluminación, dispersión débil y débil absorción de la luz por la muestra. Afortunadamente, muestras celulares sin teñir satisfacen estos supuestos y bajo iluminación NA se consigue fácilmente en microscopios comerciales. HTDIC se utiliza para obtener información volumétrica de DIC imágenes a través de enfoque a alta Illumin NAcondiciones ación. Iluminación de alta NA permite mejorada de seccionamiento de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen DIC apila en gran medida mejora algoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica utilizando microscopios "off-the-shelf". Hay dos limitaciones básicas de estos métodos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales actualmente abroga la investigación de los fenómenos más rápido que 1 cuadro / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos desde el 0,2 hasta el 10 (NIQPM) y 20 (HTDIC) micras de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, las muestras y su tiempo asociado dinámica de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos. Emocionante, cellula más fijoespecímenes r son investigados fácilmente con estos métodos.

Introducción

El uso de microscopía óptica es ahora omnipresente en la investigación de organismos celulares. Debido a su absorbancia y dispersión débil propiedades endógenas bajo sobre el espectro óptico visible, las células no afectan en gran medida la amplitud de las ondas ópticas que atraviesan ellos y por lo tanto aparecen semitransparente cuando reflejado con microscopios de campo brillante estándar. Muestras celulares no, sin embargo, reducir la velocidad ondas ópticas que viajan a través de ellos de una manera que está relacionada linealmente con la cantidad de densidad de masa local en una región particular del espacio a través del cual la luz viaja. La utilización de est....

Protocolo

1. Microscopio Especificaciones

Para llevar a cabo las imágenes de la manera correcta el microscopio debe tener las siguientes especificaciones:

1. Poseer tanto contraste de interferencia diferencial (DIC) y campo claro (BF) de contraste.
2. Tener movimiento según el eje Z controlado por ordenador.
3. Tener un tope de apertura ajustable para variar la apertura numérica de la lente de condensador. Se requiere una abertura con una regla graduada o de lectura electrónica para conocer el valor de la apertura numérica. La apertura numérica debe variar de 0,1 para NIQPM hasta 0.9 (o superior) para HTDIC.
4. El micro....

Resultados

Iluminación de la muestra correcta durante la adquisición de imágenes a través de enfoque es fundamental para la implementación exitosa de la NIQPM A ND algoritmos HTDIC. En la Figura 2 se ilustra de baja y alta iluminación NA bajo tanto DIC y contraste de campo claro para una esfera de poliestireno y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I, y 2K demuestran de formación de imágenes óptima para NIQPM. Figur.......

Discusión

En general, NIQPM es una técnica de difracción limitada validado en longitudes de trayectoria óptica que van desde 0,25 hasta 44,7. La validación se realizó en n = 1.596 esferas de poliestireno que varían en diámetro desde 0,11 hasta 9,8 micras en suspensión en Fluoromount G (datos no mostrados). Las células poseen longitudes de trayectoria óptica que van desde casi 0-7.

Cuando se mide la distribución de la densidad de una muestra se puede encontrar que la imagen DIC seudo ve bien mientras q.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio Zeiss Axio Imager 2	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemania	Microscopio	Axio Imager D2
Filtro verde (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Filtro verde
Software SlideBook 5.5	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Software de adquisición de imágenes
Poliestireno microesferas	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N Esferas	de poliestireno
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Medios de montaje