Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

Resumen

Describimos el uso de un microscopio óptico estándar para realizar mediciones cuantitativas de masa, volumen y densidad celular a través de una combinación de imágenes de campo claro y contraste de interferencia diferencial.

Resumen

Se describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo brillante y contraste de interferencia diferencial imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y distribución de la densidad subcelular, y transformada de Hilbert diferencial microscopía de contraste de interferencia (HTDIC) para determinar el volumen. NIQPM se basa en un modelo simplificado de la propagación de ondas, llamadas a la aproximación paraxial, con tres supuestos básicos: apertura numérica baja (NA) de iluminación, dispersión débil y débil absorción de la luz por la muestra. Afortunadamente, muestras celulares sin teñir satisfacen estos supuestos y bajo iluminación NA se consigue fácilmente en microscopios comerciales. HTDIC se utiliza para obtener información volumétrica de DIC imágenes a través de enfoque a alta Illumin NAcondiciones ación. Iluminación de alta NA permite mejorada de seccionamiento de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen DIC apila en gran medida mejora algoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica utilizando microscopios "off-the-shelf". Hay dos limitaciones básicas de estos métodos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales actualmente abroga la investigación de los fenómenos más rápido que 1 cuadro / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos desde el 0,2 hasta el 10 (NIQPM) y 20 (HTDIC) micras de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, las muestras y su tiempo asociado dinámica de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos. Emocionante, cellula más fijoespecímenes r son investigados fácilmente con estos métodos.

Introducción

El uso de microscopía óptica es ahora omnipresente en la investigación de organismos celulares. Debido a su absorbancia y dispersión débil propiedades endógenas bajo sobre el espectro óptico visible, las células no afectan en gran medida la amplitud de las ondas ópticas que atraviesan ellos y por lo tanto aparecen semitransparente cuando reflejado con microscopios de campo brillante estándar. Muestras celulares no, sin embargo, reducir la velocidad ondas ópticas que viajan a través de ellos de una manera que está relacionada linealmente con la cantidad de densidad de masa local en una región particular del espacio a través del cual la luz viaja. La utilización de este lapso de tiempo heterogéneo o perfil "fase" de las ondas ópticas transmitidas a través de las muestras microscópicas fue descrita por primera vez en 1935 por Frits Zernike ¹ y experimentalmente se dio cuenta por Zernikein 1942 ^2. Zernike fue galardonado con el premio Nobel en 1953 por este logro. Zeiss comercializó esta modalidad en 1945 ^3. En 1955, Smith y Nomarskme volvería a presentar su trabajo inicial sobre el uso ^{de 4} y ⁵ de la teoría de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía, una modalidad que utiliza el gradiente espacial de fase como un mecanismo de contraste. DIC fue comercializado por Zeiss en 1965in estrecha colaboración con Nomarski ^6. En 1981, dos laboratorios demostraron la primera célula viva DIC imágenes grabadas con la incorporación de cámaras de vídeo en el tren de la óptica del microscopio DIC ^{7, 8.} La era de imágenes de células vivas nació.

Desde este momento, la ejecución de tanto de contraste de fases y DIC en microscopios comerciales ha sido en gran parte sin cambios. Estos métodos se utilizan principalmente por los biólogos para producir imágenes de las células para los propósitos cualitativos: monitorización de la morfología, el seguimiento de las estructuras subcelulares, y las investigaciones de dinámica de la membrana ^9. Estas técnicas son de carácter cualitativo en su configuración "off-the-shelf" ya que tanto la fase y DIImágenes C son funciones arbitrarias de la intensidad de la fuente de luz, la configuración óptica de iluminación, y ganancia de la cámara CCD, gamma y los ajustes de exposición.

Una pequeña legión de físicos e ingenieros ópticos se ha esforzado por hacer que las modalidades de imágenes comerciales cuantitativa. Entre los primeros esfuerzos fueron dos cartas a la Naturaleza en 1952 y 1953 en los que el médico-biofísico convertido Robert Barer demostrado el uso de la microscopía de fase para determinar la masa seca celular de las células mediante la estimación de los cambios de fase a través de estos tipos de células usando un microscopio de fase disponible en el mercado ^{10, 11.} El campo se ha desarrollado una multitud de técnicas en los años siguientes con base en torno a tres mecanismos de contraste sin etiquetas básicas: microscopía de fase ^10,11, DIC microscopía ^{12-17, 18-22} y luminosa de campo para determinar la longitud del recorrido óptico, la fase, la masa densidad, índice de refracción, y el volumen celular.

En el párrafollel, una gran colección de instrumentos ópticos personalizados también se han desarrollado desde la década de 1950, y han hecho de gran alcance mediciones ópticas que van desde aplicaciones en el crecimiento del parásito ^23, a documentar el ciclo celular ²⁴ a la investigación de la dinámica de la membrana de las células rojas de la sangre ^25. En particular, los últimos diez años se ha producido una gran cantidad de microscopía cuantitativa libre de marca en forma de microscopía de fase de difracción ^26, microscopia tomográfica fase ^27, la microscopia holográfica digital ^28, sensible a la fase de microscopía de coherencia óptica ^29, la microscopía de interferencia espacial de luz ^30, Hilbert fase de la microscopía ^{de 31 años,} y la microscopía de fase cuantitativa ^32. A pesar de sus éxitos colectivos, estos instrumentos no han sido difundidos en el campo más amplio de investigadores biológicos, debido, sobre todo, a su compleja instrumentación y requerimientos computacionales.

Aquí nos describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo claro y DIC imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y la distribución de la densidad subcelular, y la transformada de Hilbert microscopía de contraste diferencial de interferencia (HTDIC), para determinar el volumen. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica. Las condiciones de formación de imágenes requeridas para su ejecución exitosa están dentro del alcance de la operación normal de la mayoría de los microscopios disponibles comercialmente. Además, los algoritmos de procesamiento posterior son estables, rápida y robusta - habiendo sido implementado en MATLAB utilizando algoritmos de transformada rápida de Fourier (FFT) basadas siempre que sea posible.

NIQPM es un método para reconstruir de fase y la densidad de masa integrado axialmente de CELespecímenes lular de brillante imaginería campo. La suma de esta densidad de masa integrado axialmente sobre el área de la muestra da el contenido en masa seca total de la muestra. El protocolo NIQPM se basa en los fundamentos experimentales establecidas por Paganin y Nugent ^{18, 19} - en el que se demostró que el perfil de fase de una célula podría ser reconstruido a partir través de enfoque de campo brillante imágenes de la muestra - y el trabajo teórico de Frank , Altmeyer, y de Wernicke ²⁰ - en la resolución de los modelos de onda paraxial de una manera eficiente basado en FFT. La conexión de fase a la densidad de masa seca se basa en el trabajo por Barer ^{10, 11} y Popescu ^33.

Información volumétrica se puede obtener de a través de enfoque DIC imágenes bajo altas condiciones de iluminación NA que permiten seccionamiento óptico de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen pilas DIC mejora muchoalgoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Este trabajo se origina con Arinson et al. ³⁴ aunque hemos introducido los dos métodos de filtrado de Fourier para mejorar el contraste y un método de detección de borde a base de Sobel para el análisis automatizado volumétrica de la muestra. También hemos validado HTDIC anteriormente en esferas de poliestireno que varían en tamaño desde el límite de difracción de hasta 20 m de diámetro ^36.

Mientras tanto NIQPM y HTDIC son tecnológicamente accesible debido a su desarrollo en microscopios comerciales, los métodos son fundamentalmente limitadas por la configuración de hardware de los propios microscopios. Las principales limitaciones de estas técnicas son de dos tipos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales, debido a la traducción de toda la etapa de la muestra en lugar de sólo la lente del objetivo, Limita la investigación de los fenómenos más rápido que más o menos 1 marco / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos que van en tamaño desde 0,2 hasta 10 y 20 m de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, la muestra y su dinámica de tiempo asociados de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos en los instrumentos típicos "off-the-shelf". Emocionantemente, la mayoría de los especímenes celulares fijos son investigados fácilmente con estos métodos.

Una visión general del NIQPM y protocolos HTDIC se dan en la Figura 1. En la figura 2 se ilustra la imagen óptima y subóptima a través de enfoque en condiciones tanto de baja y alta iluminación NA, tanto para campo claro y DIC imágenes. Las figuras 3 y 4 muestran la dependencia de parámetros del algoritmo NIQPM destacando implementaciones exitosas y no exitosas. Figura 5 ilustra los pasos involucrados en el algoritmo de procesamiento de imágenes HTDIC y demuestra la óptima implementación del algoritmo para determinar el volumen celular.

Protocolo

1. Microscopio Especificaciones

Para llevar a cabo las imágenes de la manera correcta el microscopio debe tener las siguientes especificaciones:

1. Poseer tanto contraste de interferencia diferencial (DIC) y campo claro (BF) de contraste.
2. Tener movimiento según el eje Z controlado por ordenador.
3. Tener un tope de apertura ajustable para variar la apertura numérica de la lente de condensador. Se requiere una abertura con una regla graduada o de lectura electrónica para conocer el valor de la apertura numérica. La apertura numérica debe variar de 0,1 para NIQPM hasta 0.9 (o superior) para HTDIC.
4. El microscopio debe tener un filtro de color de banda estrecha para ser utilizado para la formación de imágenes de campo brillante. Se requiere este filtro para fijar el incremento de refracción, una factura de longitud de onda dependiente utilizada para convertir la fase de densidad de masa para NIQP.

2. Diferencial de contraste de interferencia (DIC) Adquisición Z-stack

1. Abra el software de un SlideBooknd crear una nueva diapositiva para la colección de imágenes.
2. A continuación, abra la ventana de enfoque. En la sección Establecer filtro, seleccione DIC. En la ficha Cobertura, en la sección del condensador, ajuste la barra deslizante de apertura a la posición más a la derecha (abierto todo el camino). Esto proporciona iluminación de alta apertura numérica y mejora seccionamiento óptico de la muestra.
3. Centrarse en la muestra usando un objetivo de la CID. Ajuste la intensidad de la lámpara halógena hasta que la muestra es fácilmente visible. Para asegurarse de que la cámara no está siendo saturado, seleccione la ficha Cámara en la Ventana de enfoque y compruebe que el histograma de intensidades de los píxeles está dentro del rango dinámico de la cámara.
4. Abra la ventana de captura de imagen. En la sección Tipo de captura, marque la casilla 3D. En la sección de captura 3D, seleccione la Cordillera por el centro y volver a la ubicación actual cajas y especifique el rango de la dirección Z, número de planos y dimensiones de los pasos. El rango de la dirección Z debe incorporar toda la muestra.
5. En la sección de juego de filtros de la ventana de captura de imagen, marque la casilla DIC y especificar el tiempo de exposición. En la sección de información de la imagen, el nombre de la imagen (opcional) y seleccione Iniciar para iniciar la formación de imágenes.

3. Campo brillante (BF) Adquisición Z-stack

1. Una vez que el microscopio ha terminado de recoger la DIC Z-pila de la muestra, abra la ventana de enfoque y seleccione Abrir en la sección Conjunto de filtros. Ajuste el control deslizante de apertura en la posición izquierda más alejada (cerrado hasta el final) para proporcionar una iluminación baja NA.
2. Cambie el filtro de luz del microscopio a verde. Ajuste la intensidad de la lámpara halógena hasta que la muestra es visible. Asegúrese de que no hay saturación de la cámara, seleccione el ficha Cámara en la Ventana de enfoque y la comprobación de que el histograma de intensidades de los píxeles está dentro del rango especificado.
3. Abra la ventana de captura de imagen. Se mostrarán los ajustes de captura en 3D a partir de la adquisición de Z-stack DIC.
4. En la sección de juego de filtros de la ventana de captura de imagen, marque la casilla OPEN y especificar el tiempo de exposición. En la sección de información de la imagen, el nombre de la imagen (opcional) y seleccione Iniciar para iniciar la adquisición de imágenes Z-stack.

4. Exportación de Z-stack Imágenes

1. Abra una captura de Z-stack. Cambiar la vista al 100%. Ajuste el histograma de los valores de los píxeles que se mostrarán entre 0 y el valor máximo de píxeles de la cámara (4095 para 12 cámaras bits, 65.535 para 16 bits.).
2. Seleccione Ver> Exportar> Serie TIFF. Esto exportará el Z-stack como una serie de imágenes TIFF(Una para cada plano Z). Guarde la serie TIFF en una carpeta separada con un nombre que tiene un guión bajo al final (es decir, "DIC Pila 1_"). Repita esto con cada pila Z DIC o BF.

5. Mediciones del Volumen

1. Abra el programa HTDIC MATLAB titulado "JoVE_HTDIC_v1.m".
2. Bajo la Sección 0 del programa HTDIC, actualizar la variable de directorio de dependencias. Copia y pega el directorio que contiene el hilbert_transform_dic.m y archivos sobel_edge_detect.m desde el explorador (PC) entre las comillas simples siguiente "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 del programa JoVE_HTDIC_v1.m.
3. En la Sección 1, actualice la "images_directory". Una vez más, copie y pegue el directorio que contiene las imágenes a través de enfoque en. Forma tif entre las comillas simples. La única carrera SECCIÓN 1 VEZ.
4. La alineación y la rotación de imágenes para Hilbert transforman Run Sección 2 del código. Aparecerá un cuadro de diálogo titulado "Definición de Parámetros HTDIC". Cinco Numbers se requieren por parte del usuario: el número de plano focal donde la imagen DIC de la muestra está en el foco, resolución lateral (m / píxel en la imagen), la resolución axial (esto es 0,1 para la adquisición de imágenes en 0.1 micras pasos axiales), el ángulo de rotación de la imagen DIC necesarios para realizar la transformada de Hilbert, los valores típicos son 45 y -135. Por último, entrar en la región de tamaño de interés, este parámetro define la longitud de un lado de una caja que posteriormente aparecerá - valor típico es 400. Haga clic en Ok.
5. Una imagen del plano focal DIC especificado por el número de plano focal aparecerá con un recuadro azul. Coloque la caja sobre la característica de interés, por ejemplo, una célula. La caja no tiene que ser cuadrado. Una vez que la caja se ha colocado sobre la región deseada, haga doble clic dentro del área.
6. Otra figura aparecerá ahora: esta figura contiene una imagen recortada y girada de la región de interés seleccionada en el paso anterior. El contraste de la imagen debe ser talcaracterísticas que oscuras aparecen a la izquierda mientras que las características brillantes en la derecha. Arrastre el cuadro azul sobre la región de interés, formar de nuevo si es necesario.
7. Sección 3 genera una máscara para el cubo Z-pila. Hay dos tipos de máscaras disponibles: una máscara rectangular para crear un rectángulo alrededor de la célula y una herramienta de mano alzada para delinear la célula de interés con la mano.
8. Para generar una máscara rectangular, línea 167 y descomentar la línea de comentario 170 (comentar una línea a cabo mediante la colocación de un "%" al principio de esa línea). Ejecutar la Sección 3 del programa. Haga clic en la imagen y arrastre el ratón para empezar a definir la máscara rectangular. Haga doble clic en el cuadro que aceptarlo.
9. Para generar una máscara a mano, línea de comentario 167 y la línea 170 uncomment y ejecutar la Sección 3. Haga clic y dibuje la máscara que desee con el ratón. Haga doble clic en la máscara que aceptarlo.
10. Sección Ejecutar 4to construir el Hilbert transforma pila de imágenes DIC y la correspondiente imagen Pila DIC de la zona de interés.La máscara construida en la Sección 3 se aplicará a la transformación de Hilbert pila DIC y la pila normal DIC cuando "Maskon" está establecido en 1 en la línea 179. Ajuste "Maskon" a 0 construirá pilas de imágenes sin aplicar la máscara.
11. Ejecute la Sección 5 para optimizar la segmentación de la imagen de la cruz xz imágenes seccionales de la región de interés. Figura 500, producido por el programa, aparece la visualización de tres tipos diferentes de contraste. El éxito del algoritmo para encontrar los bordes de la celda depende de una combinación de la máscara utilizada y el valor de "umbral" en la línea 229 del programa. Comience con un valor de 0,5. Ajuste el valor de umbral y vuelva a ejecutar esta sección del programa hasta que se logre el delineamiento adecuado en una de las columnas.
12. Si el delineamiento fue mejor en la columna 1, utilice la sección 6 para determinar el volumen utilizando DIC segmentación de imágenes. Si la columna 2 dio óptimos resultados, ejecute la Sección 7 para determinar el volumen de células de transformada de Hilbert de imágenes DIC. Si la columna 3 gave los resultados óptimos, ejecutará la Sección 8 para determinar el volumen utilizando filtrada-Fourier transformada de Hilbert de imágenes DIC.
13. El volumen medido de la muestra, se informa en m cúbico (FL) se presenta en el título de la figura 600, 700, o 800 producido por el programa en función de la cual se elige de medición de volumen.

6. Medición de la Masa

1. Abra el programa NIQPM MATLAB titulado "JoVE_NIQPM_v1.m".
2. Bajo la Sección 0 del programa NIQPM, actualizar la ubicación de tres directorios necesarios para ejecutar el programa. Estos son los "dependencies_directory", el "brightfield_directory", y el "dic_directory."
3. A continuación, ejecute la Sección 1. Esta sección de código genera un campo brillante imagen Cubo del campo lleno de todo el conjunto de imágenes. La única carrera SECCIÓN 1 VEZ.
4. A continuación, ejecute la Sección 2. Aparecerá un cuadro de diálogo titulado "Definición de Parámetros NIQPM". Cuatro números se requieren por parte del usuario: el número de plano focal donde la imagen de campo claro de lala muestra está en el foco, la resolución lateral (m / píxel en la imagen), la resolución axial (esto es 0,1 para la adquisición de la imagen en 0,1 micras pasos axiales), y la región de tamaño de interés, este parámetro define la longitud de un lado de un caja que posteriormente aparecerá - un valor típico es 200. Haga clic en Ok.
5. Una imagen del plano focal brillante campo especificado por el número de plano focal aparecerá con un recuadro azul.
   1. Si la imagen no está enfocada, haga doble clic en el cuadro azul y vuelva a ejecutar la Sección 2, asegúrese de ajustar el número de plano focal en el cuadro de diálogo.
   2. Si la imagen está en foco, arrastre el cuadro azul alrededor de la imagen y cambiar su tamaño mediante la selección de los nodos de la caja y arrastrar según sea necesario. Coloque la caja alrededor de la característica de interés, por ejemplo, una célula. La caja no tiene que ser cuadrado. Haga doble clic dentro del cuadro para aceptarlo.
6. A continuación, ejecute la Sección 3 para construir una pila de imágenes de campo claro cultivada en la región de enterés.
7. Para generar el mapa de fases, DIC imagen de pseudo, y las comparaciones con la imagen verdadera DIC brillante imaginería campo y, a correr la Sección 4.
8. Con el seudo DIC y verdaderas imágenes DIC como similares como sea posible el mapa de densidad de masa, masa total, y el histograma de la densidad celular se puede determinar mediante la ejecución de la sección 5a o 5b. Sección 5a lleva a cabo la detección automatizada de pensionista del campo - optimizar "umbral" en la línea 300 - valores típicos varían entre 0,1-1. Vuelva a ejecutar esta sección según sea necesario para optimizar el valor de umbral. Sección 5b lleva a cabo la determinación de masas, etc después de que el usuario describe la célula de interés.

Resultados

Iluminación de la muestra correcta durante la adquisición de imágenes a través de enfoque es fundamental para la implementación exitosa de la NIQPM A ND algoritmos HTDIC. En la Figura 2 se ilustra de baja y alta iluminación NA bajo tanto DIC y contraste de campo claro para una esfera de poliestireno y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I, y 2K demuestran de formación de imágenes óptima para NIQPM. Figur...

Discusión

En general, NIQPM es una técnica de difracción limitada validado en longitudes de trayectoria óptica que van desde 0,25 hasta 44,7. La validación se realizó en n = 1.596 esferas de poliestireno que varían en diámetro desde 0,11 hasta 9,8 micras en suspensión en Fluoromount G (datos no mostrados). Las células poseen longitudes de trayectoria óptica que van desde casi 0-7.

Cuando se mide la distribución de la densidad de una muestra se puede encontrar que la imagen DIC seudo ve bien mientras q...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio Zeiss Axio Imager 2	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Alemania	Microscopio	Axio Imager D2
Filtro verde (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Filtro verde
Software SlideBook 5.5	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Software de adquisición de imágenes
Poliestireno microesferas	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N Esferas	de poliestireno
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Medios de montaje