El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en Drosophila Las larvas

Resumen

Larvas de Drosophila son un sistema modelo atractivo para imágenes en vivo debido a su cutícula translúcida y la genética de gran alcance. Este protocolo describe cómo utilizar un dispositivo de PDMS de una sola capa, llamada el 'chip de larva' para imágenes en vivo de procesos celulares dentro de las neuronas de 3 ^º estadio las larvas de Drosophila.

Resumen

Imágenes en vivo es una técnica importante para el estudio de los procesos biológicos celulares, sin embargo esto puede ser difícil en los animales vivos. La cutícula translúcida de la larva de Drosophila lo convierte en un organismo modelo atractivo para los estudios de imagen en vivo. Sin embargo, un importante reto para las técnicas de imagen en vivo es inmovilizar de forma no invasiva y la posición de un animal en el microscopio. Este protocolo presenta un método simple y fácil de usar para la inmovilización y proyección de imagen larvas de Drosophila en un polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivo de microfluidos, lo que llamamos el "chip de larva. El chip de la larva se compone de una microcámara de PDMS ajustada al cuerpo que está conectado a un cubreobjetos de vidrio delgada, que, tras la aplicación de un vacío a través de una jeringa, inmoviliza el animal y trae estructuras ventrales tales como el cordón nervioso, los nervios segmentarios, y el cuerpo músculos de la pared y muy próximo a la cubreobjetos. Esto permite la formación de imágenes de alta resolución, y lo más importante, evita el uso de anesthetics y productos químicos, lo que facilita el estudio de una amplia gama de procesos fisiológicos. Desde larvas recuperar fácilmente de la inmovilización, que pueden ser sometidos fácilmente a múltiples sesiones de formación de imágenes. Esto permite que los estudios longitudinales sobre los cursos de tiempo que van desde horas hasta días. Este protocolo describe paso a paso cómo preparar el chip y la forma de utilizar el chip para imágenes en directo de eventos neuronales en 3 ^º estadio las larvas. Estos eventos incluyen el rápido transporte de orgánulos en los axones, las respuestas de calcio a una lesión, y los estudios de lapso de tiempo del tráfico de proteínas de calidad fotográfica convertible a largas distancias y escalas de tiempo. Otra aplicación del chip es estudiar regenerativa y respuestas degenerativos de lesión axonal, por lo que la segunda parte de este protocolo describe un procedimiento nuevo y sencillo por herir a los axones en nervios periféricos por un aplastamiento del nervio segmental.

Introducción

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido utilizada como organismo modelo para los más de 100 años, y ha demostrado ser fundamental en la definición de señalización fundamentales y las vías de desarrollo que se conservan desde los invertebrados a humano. Imágenes en vivo es un enfoque importante para el estudio de los mecanismos celulares y el plan corporal simple y cutícula translúcida de la larva de Drosophila hace que sea un atractivo sistema de imágenes en vivo, sobre todo porque hay muchas herramientas genéticas disponibles para la expresión de proteínas fluorescente etiquetados en tipos celulares específicos.

Un reto importante para las técnicas de imagen en vivo es inmovilizar de forma no invasiva y la posición de un animal para la microscopía. Enfoques de inmovilización convencionales incluyen la disección ^1,2 o el uso de cloroformo, tanto de los que matan el animal. Los anestésicos éter ⁴ y isofluorano ^5-8 también se han utilizado. Los anestésicos proporcionan muchas ventajas, Sino que también inhiben la actividad de los nervios y de la fisiología importantes (incluyendo los latidos del corazón) ^9-11, por lo tanto, puede afectar el proceso de estudio y crear estrés en el animal. También hay preocupaciones sobre la seguridad humana para trabajar con éter y isofluorano.

Hemos desarrollado un método libre de drogas para inmovilizar las larvas de Drosophila en un único dispositivo de microfluidos PDMS capa, lo que llamamos el "chip de larva ^'12. Este protocolo se describe cómo obtener o hacer que el chip de larva, y la forma de utilizarlo para imágenes en vivo en las primeras etapas larvas 3 ^rd. El chip se compone de una microcámara ajustada al cuerpo, que, tras la aplicación de un vacío a través de una jeringa, inmoviliza el animal a través de la fuerza mecánica suave. El método de inmovilización trae estructuras ventrales como el cordón nervioso, los nervios segmentarios, y músculos de la pared del cuerpo, en las proximidades de un cubreobjetos de vidrio. Esto permite una alta resolución de imágenes de este tipo de estructuras con alta aper numéricatura (alta magnificación) objetivos.

Ventajas del chip larva sobre otras técnicas convencionales incluyen las siguientes: (i) El uso del chip de larva reemplaza el uso de productos químicos, lo que permite formación de imágenes in vivo de animales no anestesiados. (Ii) Las larvas se recuperan inmediatamente después de la liberación desde el chip (en contraste con un período de recuperación de 2 h para isofluorano ^8,13). Esto permite obtener imágenes en escalas de tiempo amplios, que van desde milisegundos a minutos, a horas y días. (Iii) El uso de PDMS, que es un material permeable a los gases, permite la difusión continua de oxígeno / aire desde el medio ambiente en el cuerpo larva. (Iv) El chip es fácil y seguro de usar, y (v) es reutilizable, y puede ser fabricado a un costo mínimo.

Además de las instrucciones para el uso del chip de la larva, este protocolo proporcionará varios ejemplos de su uso para estudiar eventos neuronales en 3 ^ª estadio las larvas. Estos incluyen imágenes en vivo de Axonal transporte, respuestas de calcio a una lesión, y los estudios de lapso de tiempo del tráfico de proteínas de calidad fotográfica convertible a largas distancias y escalas de tiempo.

Otra aplicación del chip es para estudiar las respuestas neuronales a la lesión axonal. Para ello un procedimiento adicional se describe (en la parte 3) por herir a los axones en nervios periféricos por un aplastamiento del nervio segmental. Este sencillo ensayo se puede realizar tanto rápidamente y de manera reproducible en un estereomicroscopio de disección estándar, que permite para muchos animales para ser procesados ​​al mismo tiempo. Las respuestas celulares a la lesión pueden ser estudiados mediante imágenes en directo en el chip de larva.

Protocolo

1. Hacer que el chip PDMS

Para hacer que un chip de PDMS del molde SU-8, siga los pasos 1.1 a 1.7. Si un chip es a la mano, pero necesita montado para su uso, vaya al paso 1.8.

1. Mezclar 45 g de base de PDMS y 4,5 g de agente (10:1) curar de un kit de PDMS en un pequeño recipiente de plástico desechable y mezclarlos bien con una varilla de agitación de plástico.
2. Coloque el recipiente en un recipiente de vacío (por ejemplo, un desecador) durante 10 min para eliminar las burbujas.
3. Coloque el molde SU-8 en la parte inferior de un 150 mm de diámetro plato de plástico y se vierte lentamente la mezcla de PDMS en el molde. Tenga cuidado de no generar burbujas mientras se vierte el PDMS.
4. Curar el PDMS en un horno (o incubadora) a 650 ° C durante 4 h.
5. Retire el molde PDMS/SU-8 curado del horno y deje que se enfríe durante unos minutos.
6. Uso de una hoja de afeitar, cortar el PDMS curado a lo largo del borde del molde SU-8 y separarla de SU-8 molde.
7. Divida la losa PDMSen PDMS chips individuales utilizando una hoja de afeitar.
8. Usando una aguja de dispensación 21 G, hacer un agujero en el puerto de vacío (representado en la Figura 1A) del chip de PDMS.
9. Tome una aguja dispensadora 23 G y gire la punta de la aguja de su base un par de veces para romper la punta de la aguja fuera del cubo de bloqueo.
10. Inserte la punta de la aguja 23 G en un pequeño trozo de tubo de polietileno para que la tubería cubre al menos un milímetro de la aguja. A continuación, utilice una hoja de afeitar para cortar el exceso de tubo lejos de la aguja. Esto crea un anillo de plástico alrededor de un extremo de la aguja, lo que creará un sello cuando se inserta en el orificio de admisión de vacío.
11. Para el uso con un microscopio invertido (Figuras 1B y 2A-B): insertar la punta de la aguja 23 G en el orificio del puerto de vacío. Para el uso con un microscopio vertical (figuras 1C y 2C-D): meter un segundo agujero en el lado del chip de PDMS con un Pinturas de 21 Gnsing aguja; este agujero proporcionará acceso al primer orificio desde el lado. A continuación, inserte la punta de la aguja 23 G con anillo de tubo en el orificio lateral. Coloque un trozo de cinta de doble cara en la parte superior del chip PDMS para sellar el orificio superior (Figura 1C).
12. Tome un pedazo de tubo de polietileno que es de aproximadamente 20 cm de longitud. Conectar un lado de la tubería a la punta de la aguja que se inserta en el puerto de vacío.
13. Conectar el otro lado de la tubería a uno de los puertos de una válvula de 3 vías (ver '3-manera llave de paso 'en la lista de materiales)
14. Acople una jeringa de 20 ml en una de dos puertos restantes. El último puerto está abierto al medio ambiente.

2. Usando la viruta Larva de imágenes en vivo

1. Limpie el chip PDMS con cinta adhesiva transparente. Adjuntar un trozo de cinta adhesiva a la parte inferior de la viruta. Asegúrese de que la cinta está en contacto con toda la superficie de PDMS y, a continuación, pelar la cinta.
2. Repita el paso anterior 2-3x para asegurarse de quehay partículas o aceite (retenidas a partir de experimentos anteriores) en la superficie del chip de PDMS. Dado que el chip de PDMS es reutilizable, es muy importante para eliminar los residuos de aceite, ya que puede afectar a la adherencia de PDMS al vidrio y resultar en de sellado insuficiente.
3. Traslado temprano (es decir, búsqueda de alimento) larvas 3 ^º a una placa de Petri que contiene agua. (El ^tercer instar de larvas de etapa de alimentación 3 se encuentran en la comida, en lugar del lado del vial de cultivo). Bañe a las larvas en agua para eliminar el medio de cultivo.
4. Tome un cubreobjetos de vidrio limpio y coloque una pequeña gota de aceite Halocarbon 700 en su centro.
5. Con unas pinzas, pick suavemente hacia arriba un limpio, las primeras etapas 3 ^º estadio larva del agua (la larva debe ser ~ 3.5-4 mm de largo). Colocar el animal brevemente en un ligero limpie o toalla de papel para eliminar el exceso de agua y, a continuación, colóquelo en la gota de aceite. La caída debe ser lo suficientemente pequeño tal que la tráquea de las larvas no están recubiertos. Deje que el sta larvaY en la gota de aceite para 10 seg.
6. Retire la larva de la gota de aceite y luego se coloca en un portaobjetos de vidrio limpio.
7. Transfiera la larva a otro cubreobjetos de vidrio limpio. Este paso elimina el exceso de aceite.
8. Preste atención a la orientación larva. Para obtener imágenes de la médula espinal y los nervios segmentarios neural, la parte ventral de la larva debe sentarse en el cubreobjetos. Su lado dorsal, caracterizado por dos tubos traqueales longitudinales, debe estar hacia arriba. Nota: esta es la orientación de la larva prefiere naturalmente.
9. Coloque con cuidado el chip PDMS en la parte superior de la larva. La larva se debe alinear a medio centro de la microcámara, con su cola orientada hacia el orificio de vacío. Tenga cuidado de que la larva no toque los bordes de la cámara. Esto es especialmente importante para los terminales anterior y posterior de la tráquea. Nota: este paso se realiza mejor bajo un microscopio estereoscópico.
10. Empuje el chip PDMS contra el cubreobjetos de vidrio para lograr un buen sellado. Asegúrese de que la larva está completamentedelimitada por la microcámara cuando el chip PDMS está tocando el cubreobjetos de vidrio.
11. Cambie la válvula de 3 vías en tal forma que la jeringa puede aspirar aire de la microcámara de PDMS (a través de la tubería) para crear un vacío.
12. Con una mano, sujete firmemente el cubreobjetos chip de PDMS / vidrio. Use la otra mano para tirar el émbolo de la jeringa. Retirar 2-2,5 ml de aire, hasta sentir una resistencia en el mango de la jeringa, para crear el vacío. El vacío produce un sello hermético entre el chip de PDMS, aceite, y las interfaces de cubreobjetos y restringe la movilidad de la larva.
13. Cambie la válvula de apagado de tal manera que el chip de PDMS está aislado de la jeringa y del medio ambiente. Como resultado, un nivel de vacío relativamente estable se mantiene en la microcámara sin la necesidad para sujetar el émbolo de la jeringa.
14. Comprobar la larva bajo el estereoscopio para asegurarse de que todo el cuerpo del animal se coloca dentro de la microcámara, y que el animal es inmóvil. La tráquea debe ser visible. El resto de laChip de PDMS debe estar en contacto con el cubreobjetos. Nota: Vea las figuras 2E y 2F de ejemplos de animales correctamente inmovilizadas en el chip. Algunas orientaciones incorrectas se muestran en las Figuras 2G y 2H.
15. Coloque el chip larva (chip de PDMS + cubreobjetos de vidrio) en el microscopio. El chip de larva, el tubo y la jeringa se deben manejar con cuidado para evitar el desprendimiento de la viruta PDMS del cubreobjetos. Para un microscopio vertical, fije la parte "superior" del chip a la platina del microscopio con cinta de doble cara (Figura 1C).
16. Utilice un objetivo de gran aumento (inmersión en aceite, se recomienda 40-63X) para localizar la estructura (s) de los animales de interés y llevar a cabo la formación de imágenes. En algunos casos, puede ser necesario un aumento menor para identificar la región deseada para la formación de imágenes antes de cambiar a un aumento mayor.
17. Cuando se termina de formación de imágenes, liberar el vacío por conmutación de la válvula a la posiciónque está abierto al medio ambiente.
18. Desmonte el chip PDMS del cubreobjetos. La larva debe ser inmediatamente móviles.
19. Use unas pinzas para quitar la larva de la microcámara y suavemente coloque la larva en una placa de agar jugo de uva para la recuperación.

3. La inducción de una lesión por aplastamiento del nervio a los nervios de las larvas segmentarias

1. Siga el paso 2.3 anterior para aislar principios etapas 3 ^º estadio las larvas del genotipo deseado. Tal como se describe en el paso 2.3 se bañan las larvas en el agua para retirar los alimentos.
2. Utilice una estación de anestesia estándar elevado de CO _2, con CO ₂ pad mantiene bajo un microscopio estereoscópico de disección, para someter a las larvas. Las larvas se convierta inmóviles después de la colocación de CO ₂ de la almohadilla durante 1-2 minutos.
3. Ahora coloque una sola larva anestesiado sobre una placa de agar jugo de uva bajo el microscopio estereoscópico. Gire la parte ventral de los animales hasta visualizar el cordón nervioso ventral y segmentaria nervios a través de la cutícula ( Figura 3). Asegúrese de que la larva está completamente inmóviles.
4. Usando Dumostar número 5 fórceps, pellizcar los nervios segmentarios bien a través de la cutícula durante 5-10 segundos. Cuando esto se hace correctamente, la cutícula se mantiene intacto y la pared del cuerpo no se perfora. Nota: La lesión puede llevar a cabo en diferentes posiciones a lo largo del eje del cuerpo anterior-posterior, siempre y cuando el cable de nervio ventral, glándulas salivales, y los intestinos no están dañados. La ubicación lesión más eficaz es hacia el final del segmento abdominal 3 ^ª, como se muestra en la Figura 3D. Lesión en este consultorio daña los nervios y la mayoría es el más fácil de reproducir sin matar al animal.
5. Después de la lesión, gire el animal de manera que su cara ventral hacia abajo la placa de uva. Debe ser capaz de mover su cabeza y comer. Si la lesión se ha realizado correctamente, entonces se paralizó la mitad posterior de la larva.
6. Mantener a los animales heridos en la placa de agar jugo de uva a 25 y# 176; C durante el tiempo deseado de acuerdo con el objetivo experimental. Para motoneuronas, el muñón proximal comienza a brotar dentro de 8-10 horas de la lesión ^14, y el muñón distal empieza a degenerar en 6-8 horas ^15. Para neuronas sensoriales clase IV da, el muñón proximal comienza a brotar dentro de 4-6 horas, y el inicio muñón distal a degenerar en 3-4 horas después de la lesión. Nota: con los controladores adecuados Gal4 y reporteros fluorescentes, el surgimiento y la degeneración se puede observar en el chip de larva (por ejemplo, véase la Figura 6).

Resultados

El chip de la larva se compone de un solo bloque de PDMS capa, (un chip de PDMS) cuyo diseño se describe en esquemática en la Figura 1. (Véase también el archivo DXF suplementario para el diseño de su propio molde). La microcámara larva, puerto de vacío, y los canales perimetrales (Figura 1A) son 140 micras indentaciones en el chip de PDMS. El chip se coloca en la parte superior de una de las primeras etapas 3 ^º estadio de larva, que se apoya en la parte superior de un cubreobjetos con aceite (Figuras 1B y 1C). La interfaz aceite-vidrio entre el cubreobjetos y el chip de PDMS permite un sello que se crea tras la aplicación de un vacío suave. Este sello atrapa las larvas dentro de la cámara, y desde principios por etapas 3 ^º estadio de larva es ligeramente más gruesa que la cámara, sellando la cámara crea algunos constricción física en el animal, con eficacia de inmovilización y restringir su movimiento. En este estado inmovilizado, cierta ventrallas estructuras del cuerpo, tales como el cordón nervioso ventral y segmentaria son empujados cerca de cubreobjetos. Esto es ventajoso para la formación de imágenes, ya que en el estado inmovilizado estas estructuras pueden estar dentro de la distancia de trabajo de 40X y 63X objetivos. Después de que se libera el vacío, la larva se puede quitar fácilmente de la microcámara, permitiendo experimentos adicionales que se deben realizar. Este enfoque inmovilización puramente mecánica puede mantener 90% de larvas vivas después de períodos de inmovilización continuas de hasta 1 h ^12.

El vacío se crea mediante una jeringa de 20 ml, por lo tanto, toda la unidad es fácil de transportar de un estereomicroscopio, donde se realiza el posicionamiento en la cámara, a un microscopio confocal o de epifluorescencia, donde se realiza la formación de imágenes en vivo. La jeringa se conecta al puerto de vacío a través de un tubo de polietileno y 23 g agujas de distribución (con los ejes de bloqueo eliminadas), tal como se describe en los pasos 1.6 a 1.14. Para microscopios invertidos, la tuberíay la jeringa se conecta a través de la parte superior del chip (Figuras 1B, 2A, y 2 B). Para microscopios verticales, que están conectados a través de un puerto en el lado del chip (Figuras 1C, 2C, y 2 D). La configuración para microscopios invertidos es algo más fácil de utilizar. La jeringa se tira para crear un vacío suave (de aproximadamente 10 psi), que se une la interfaz aceite-vidrio-PDMS para formar un sello hermético entre el cubreobjetos y el dispositivo de PDMS, atrapando e inmovilizando la larva dentro de la cámara.

La colocación de la larva en la microcámara (pasos 2.7 a 2.10 en el protocolo) es crítica para la inmovilización y la supervivencia (Figuras 2E-H) eficaz. Si al animal es demasiado grande para la cámara, (Figura 2G), o si la cabeza o la tráquea se convierten atrapado entre el borde de la cámara y las cubiertasel labio (Figura 1H), entonces es poco probable que sobreviva al procedimiento.

Los siguientes son varios ejemplos de la utilización del chip de larvas para estudiar diversas respuestas celulares en las neuronas (Figuras 4-7, la película de S1 y la película de S2).

Obtención de imágenes de transporte axonal rápido: El chip larva se utilizó para la imagen de transporte quinesina-mediada de las vesículas sinápticas dentro de los axones periféricos individuales (Figura 4 y la película de S1) El anterógrada (~ 1,0 m / seg) y retrógrada (~ 0,8 m / seg. ) El movimiento de estas vesículas se puede estudiar fácilmente de películas recogidos en un microscopio confocal de disco giratorio.

Colocación del animal para la microcirugía láser:. Una dendrita de la neurona sensorial se cortó transversalmente el uso de un láser de colorante pulsado UV (Figura 5 y la película de S2) Protocolos para el uso de tsu método para la microcirugía se puede encontrar en otros lugares ^16,17. La técnica de inmovilización eficiente permite que los cambios de escala de tiempo rápido en la neurona lesionada, como los cambios en el calcio intracelular (detectadas por el codificado genéticamente Ca ^{2 +} GCamp3.0 indicador ^18), para ser detectados y medidos (Figura 5).

Estudio de las respuestas regenerativas y degenerativas a la lesión: Si se permite que el animal para descansar entre las sesiones de formación de imágenes, el chip larva entonces ser utilizado para estudiar los eventos celulares que se producen en una amplia gama de escalas de tiempo. Por ejemplo, tanto 'regenerativa' y respuestas degenerativas a lesión axonal, que tienen lugar a través de una escala de tiempo de 15 horas, se pueden obtener imágenes en el chip de larva (Figura 6). En este ejemplo, los axones de las motoneuronas octopaminergic resultaron heridas a través del aplastamiento del nervio segmentaria (Figura 3), que se describe en la parte 3 del Protocolo. El muñón proximal del axón,que se somete a nueva brotación, y los axones distales, que forman varicosidades y luego se fragmentan a través del proceso de degeneración walleriana, se pueden obtener imágenes y estudió en diferentes intervalos de tiempo después de la lesión.

Seguimiento de proteínas fluorescentes fotoconvertible con el tiempo in vivo: El desarrollo de las proteínas fluorescentes fotoconvertible, cuya fluorescencia cambia irreversiblemente cuando se expone a la luz UV) permite que se etiquetan específicamente un subconjunto de proteínas dentro de una célula, y realizar el seguimiento del destino de las proteínas marcadas con el tiempo ^{19 , 20.} Esta técnica se lleva a cabo más comúnmente en cultivo de células, sin embargo, con el chip de la larva se puede realizar un seguimiento de las proteínas fotoconvertible codificados genéticamente dentro de las células definidas en vivo. A modo de ejemplo se muestra que la proteína de fusión Denda2-α-tubulina, expresada en las neuronas sensoriales clase IV da, se puede photoconverted en los cuerpos celulares (Figuras 7A y B). El transporte de las proteínas photoconverted puede entonces ser seguimiento en el tiempo: dentro de dos días se podría detectar una cantidad significativa de proteína photoconverted dentro de los terminales de los axones de las neuronas sensoriales, que se encuentran ~ 1 mm de distancia de la ubicación original en el cuerpo celular (Figuras 7A y 7 C).

Todos los ejemplos descritos (figuras 4-7 y Películas S1 y S2) se obtuvieron imágenes utilizando un sistema confocal de disco giratorio, que consiste en un escáner de Nipkow CSU10 y una cámara EMCCD C9100-50, montados en una Axio Observer con 63X (1,5 NA) objetivo de aceite, y que utilizan un software de adquisición Volocity.

Figura 1. caricaturas esquemáticos para usar el chip de larva.
(A) El chip larva está compuesto por el chip de PDMS, se indica en azul claro, se adhirió a un cubreobjetos de vidrio. El chip contiene 140 micras de espesor, canales de microfluidos que se indican en blanco. La microcámara central está diseñado para encajar cómodamente uno de los primeros en escena 3 ^º estadio Drosophila larva (cartooned en verde claro). Un fichero DXF que contiene las dimensiones exactas que se pueden utilizar para diseñar el molde se proporciona como datos complementarios. (BC) Side-vistas de esquemas para la carga de una larva en un chip larva Barra de escala = 1,5 mm.. La larva se sienta parte ventral hacia abajo en un cubreobjetos, y su cuerpo se encuentra dentro de la profunda microcámara 140 micras. Un ml de la jeringa 20 está conectado al orificio de admisión de vacío y se utiliza para inducir un vacío suave. La interfaz aceite-PDMS-vidrio Halocarbon está obligado por el vacío en un sello hermético, lo que restringe la larva de la microcámara. Este sello es fácilmente reversiblepor la liberación de la presión de la jeringa, después de lo cual el animal recupera de inmediato la motilidad. Para microscopios verticales (B), la jeringa de vacío está conectado mediante un tubo de polietileno-50 desde la parte superior del chip. Para microscopios invertidos (C), estas conexiones se realizan desde el lado del chip, mientras que el "superior" del chip está unido a la platina del microscopio a través de la cinta de doble cara.

Figura 2. Imágenes de chips de PDMS y el correcto posicionamiento de larva.
(AD). Fotografías que muestran PDMS chips para microscopios invertidos y verticales. El G punta 23 de la aguja de dispensación ha sido insertado en el puerto de vacío, que permite la conexión a través de la tubería a la de vacío (jeringa). Barra de escala = 1,5 mm. (EH). Drosophila inmovilizada. E y F muestran ejemplos de animales inmovilizados correctamente. El animal más pequeño en F es preferible que se llevarán a cabo varias imágenes en escalas de tiempo largo (> 12 h). G muestra un animal que es demasiado grande, y H muestra un animal pequeño que se coloca de forma incorrecta. Barra de escala = 1,5 mm. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Nervio lesión por aplastamiento de los nervios segmentarios en larvas de Drosophila.
(A) de la historieta de la prueba de aplastamiento del nervio. Los nervios segmentarios dentro de una 3 ^ª (B) Vista de larvas del sistema nervioso de un animal disecado 20 horas después del aplastamiento del nervio. La inmunotinción para las membranas neuronales con anticuerpos anti-HRP (rojo) se destacan los lóbulos cerebrales, cordón nervioso ventral y los nervios segmentarios largas que contienen las neuronas motoras y los axones de las neuronas sensoriales. Un subconjunto de neuronas motoras individuales están etiquetados por conducir expresión de UAS-mCD8-GFP (verde) con el conductor m12-Gal4. Los cuerpos celulares y dendritas de estas neuronas se encuentran en el cordón nervioso ventral, mientras que sus axones se proyectan a músculos de la pared del cuerpo a través de los nervios segmentarios. (Este controlador también conduce la expresión de GFP en el músculo 12 para cada hemisegment larvas, que en conjunto puede ser visto como rayas anterior-posterior a cada lado del animal). La región dañada por el enamoramiento se resalta con líneas de puntos azules. Barra de escala = 70 m. (C) Cierre de vistas de los axones dañados, 20 horas después de la lesión. Izquierda: elaxón proximal ha sido objeto de la germinación y crecimiento de nuevo. Derecha: el axón distal está fragmentado, con poca GFP restante, debido a la degeneración walleriana y remoción de escombros. Barra de escala = 10 m. (D) Las imágenes de la compresión del nervio en una de las primeras 3 ^º estadio larva. La flecha roja indica el cordón nervioso ventral. La ubicación de la aglomeración es hacia la parte inferior de la tercera segmento, como se describe en el texto del Protocolo (Protocolo 3). Las imágenes en D se publicaron originalmente en J. Cell Biol. 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Time-lapse de transporte axonal de vesículas sinápticas peptidérgicas. Elrata péptido natriurético auricular ANF etiquetado con GFP, UAS-ANF-GFP ^21, se expresó en neuronas motoras específicas utilizando el controlador de eve-RRa-Gal4 ^22. Imágenes en vivo de los nervios segmentarios revela el rápido transporte de ANF-GFP etiquetados vesículas peptidérgicas en los axones. Ver también la película de S1. (A) los marcos individuales de los axones de motoneuronas de time-lapse en vivo. Las flechas verdes, rojas y azules indican ejemplos de anterógrada, vesículas estacionarios y retrógrados, respectivamente. Barra de escala = 5 m. (A ') plazos individuales de la película se fusionaron utilizando ImageJ. (B) A quimógrafo generada a partir de time-lapse de transporte ANF-GFP, se genera a partir de una colección de cuadros individuales que abarcan un minuto de tiempo de formación de imágenes a través del "Quimógrafo Múltiple 'plug-in para ImageJ ^23. (C) Cuantificación de las velocidades segmentarias promediados, que se calcularon a partir de las pendientes de las huellas segmentados en kymographs. La barra verde presenvelocidad ts anterógrada segmentaria (n = 543) y la barra azul presenta la velocidad retrógrada segmentaria (n = 548) de las vesículas de 10 kymographs. (D) Cuantificación de la densidad de las partículas. Densidad de partículas se midió por el número de anterógrada (se muestra en la barra verde), partículas estacionarias (se muestra en la barra roja) y retrógradas (se muestra en la barra azul) por 100 m de la longitud del axón de 10 kymographs. Los datos de esta figura también se publicaron previamente en Ghannad-Rezaie et al, PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).

Figura 5. El uso del chip de larva para la microcirugía láser y de imágenes de calcio.
Una dendrita de una neurona sensorial Clase IV se secciona por con pulsos de alta potencia del láser de colorante pulsado láser UV. Los protocolos para el uso de este método para la microcirugía se pueden encontrar en otros lugares ^16. La inmovilización eficaz en el chip larva permite cambios rápidos en los niveles de calcio intracelular para ser estudiados por la imagen en vivo. En este ejemplo, el Indicador de calcio GCaMP3.0 codificados genéticamente se expresó en la Clase IV dendríticas arborización (C4da), las neuronas sensoriales mediante el controlador de PPK-Gal4. (A) imágenes con lapso de tiempo de intensidad GCaMP3.0 eran de color falso, según el color escala de intensidad para indicar los cambios en la intensidad con el tiempo. Fotogramas individuales fueron extraídos de una película de lapso de tiempo (Película S2) fotografiado en un microscopio confocal de disco giratorio en 5 cuadros / seg. (B) Cuantificación de la dinámica del calcio en respuesta a la microcirugía láser. El cambio veces normalizada del soma GCaMP3.0 intensidad de fluorescencia (ΔF/F0) de las neuronas individuales se graficó contra el tiempo (n = 7, se muestra en gris). El ΔF/F0 promedio estuvo representado en naranja. Se observó el pico de aumento de la intensidad GCaMP3.0 entre 1-2 segundos después del ataque. Antecedentes se resta de la intensidad de fluorescencia G-CaMP3.0 prima. Los datos de esta figura también se publicaron previamente en Ghannad-Rezaie et al, (2012) PLoS One 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 ^12.

Figura 6. Imaging axonal y degeneración utilizando el chip de larva. Confocal de imágenes representativas del muñón proximal (izquierda) y el muñón distal (derecha) de los axones de motoneuronas octopaminergic en diferentes puntos temporales después del aplastamiento del nervio. Las imágenes fueron tomadas en lugares similares como se muestra en la Figura 3C. Estas neuronas están etiquetados por conducir la expresión de un transgén UAS-mCD8-RFP usando el TDC^24,25 controlador 2-Gal4. Los cuerpos celulares de estas neuronas se encuentran en el cordón nervioso ventral ^24. Tres axones individuales pueden ser vistos dentro de un solo nervio segmentaria, y se resuelven fácilmente el uno del otro. Esta es una situación ideal para el estudio de los acontecimientos celulares individuales, tales como la fragmentación de los axones degenerados, que se completa en 15 h para estas neuronas. Las imágenes fueron obtenidas de animales vivos que utilizan el chip de larva a 63X aumentos en un microscopio confocal de disco giratorio. Las barras de escala = 10 micras para paneles de la izquierda (muñones proximales) y 20 micras para paneles de la derecha (tocones distales). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 7. El uso de la larvachip para el seguimiento de las proteínas fluorescentes photoconverted sobre largos tiempos y distancias en los animales vivos.
En este ejemplo, una proteína de fusión de la proteína fluorescente fotoconvertible Dendra2 ^19, fusionado a α-tubulina, se expresa a partir de un transgén UAS-Dendra2-α-tubulina en Clase IV arborización dendrítica (C4da), las neuronas sensoriales, mediante el controlador de PPK-Gal4 ^26. (A) Esquema para el experimento de fotoconversión. Los cuerpos celulares de las neuronas C4da se encuentran en la periferia y se extienden axones a través de los nervios segmentarias para formar terminales sinápticas en el cordón nervioso. El Dendra2-α-tubulina dentro de un subconjunto de los cuerpos celulares en la mitad posterior del animal se somete a fotoconversión por iluminación UV durante 6 s usando un filtro DAPI estándar con lámpara de Hg (de dibujos animados de la izquierda). Después de un tiempo, el Dendra2-α-tubulina photoconverted puede ser detectado en los terminales sinápticas en el cordón nervioso ventral. Esto indica que la proteína tubulina se ha tranlucía una larga distancia (de ~ 1.2 mm). Imágenes Barra de escala = 1 mm (B) Ejemplo de Dendra2-α-tubulina en un cuerpo celular de la neurona sensorial de clase IV antes y después fotoconversión. Barra de escala = 5 m. (C) imágenes de ejemplo de las terminales sinápticas de las neuronas sensoriales de clase IV, ya sea en las 0 horas o 48 horas después de fotoconversión de los cuerpos celulares. El aspecto específico de photoconverted Dendra2-α-tubulina en los terminales sinápticos después del tiempo implica que la proteína viajó desde el cuerpo celular al terminal del axón. Fotoconversión y de imagen en todos los puntos de tiempo se llevó a cabo en el chip de larva. Barra de escala = 15 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Película S1. microcirugía láser y de imágenes de calcio de una neurona C4da. Un láser UV pulsada se utiliza para seccionar un primrama dendríticas ary. Transección láser induce un rápido incremento en la intensidad GCaMP, que comenzó en el lugar de la lesión y viajó al cuerpo celular. UAS-GCaMP3.0 ¹⁸ se expresó mediante el controlador de PPK-Gal4 específica C4da ^26. Las películas eran falsos colores para indicar los niveles de intensidad relativa de GCaMP3.0. El time-lapse se llevó a cabo con el disco giratorio microscopía confocal en 5 cuadros / seg.

Película S2. transporte axonal rápido de ANF-GFP en las motoneuronas.
La rata péptido natriurético atrial ANF etiquetado con GFP, UAS-ANF-GFP ^21, se expresó en neuronas motoras específicas utilizando el controlador de eve-RRa-Gal4 ^22. El transporte de estas vesículas peptidérgicas dentro de los nervios segmentarios de larvas fue fotografiada en el chip de la larva a 300 mseg / marco utilizando un microscopio confocal de disco giratorio.

Figura 1 complementario (archivo DXF)
DXF para la fabricación de moldes de silicona. El archivo está diseñado para la máscara de resina fotosensible negativo (mascarilla presentado oscuro para SU-8) en una oblea de silicio de 4 pulgadas. La segunda fila contiene 5 moldes para la fabricación de los chips de larva utilizados en este protocolo. Cada uno de estos chips (en la fila 2) contienen una cámara de ~ 5,4 mm x 1,5 mm diseñado para adaptarse a una etapa temprana 3 ^º estadio de larva. La primera fila (fila 1) contiene una cámara más grande (~ 5,4 mm x 2 mm), mientras que la tercera fila (fila 3) contiene una cámara más pequeña (~ 4,4 mm x 1,5 mm). Estos pueden ser utilizados con larvas de tamaños más grandes y más pequeñas, respectivamente. Barra de escala = 2 mm.

Discusión

Realizar u obtener el chip larva:

El chip larva se compone de un bloque de PDMS (denominado el 'chip de PDMS') unido a un cubreobjetos de vidrio. El protocolo en el paso 1 se describe el procedimiento para la elaboración y el uso de chips de larva, suponiendo un molde de SU-8 está disponible. El molde SU-8 está microfabricado por fotolitográficamente modelar un 140 m de espesor SU-8 capa de resina fotosensible en una oblea de silicio (para más detalles véase Ghannad-Rezaie et al. ^12). A medida que la microfabricación del molde SU-8 requiere el acceso a un equipo especializado, le recomendamos que ordene desde una instalación de microfabricación (por ejemplo. La instalación LNF en la Universidad de Michigan ^14), o de una fundición enviándoles el diseño de chips que se proporciona como un archivo adicional. Si uno desea cambiar el diseño del chip de PDMS (por ejemplo, para su uso con larvas de diferentes tamaños), un software de CAD que se encarga de archivos DXF (por ejemplo, AutoCAD) se puede utilizar. Una SU-8 moho también puede ser hecho en casa siguiendo las instrucciones de Mondal et al. ²⁷ Muchos lectores les puede resultar conveniente para simplemente obtener un chip PDMS muestra para probar la técnica antes de fabricar sus propios chips. Esto se hará libremente disponibles bajo petición.

El uso del microfluidos 'chips larva' para imágenes en vivo:

El método de inmovilización en el chip larva evita el uso de anestésicos, y en su lugar implica la presión, a través de la aplicación de un vacío, para restringir el movimiento del animal. Mientras que los animales pueden sobrevivir a la inmovilización en el chip para múltiples hora ^12, un período de inmovilización más corta (5-15 min) se recomienda. Este es el tiempo suficiente para obtener imágenes de muchos eventos celulares de interés, incluyendo cambios en el calcio intracelular, o transporte axonal rápido. Este es también el tiempo suficiente para que las manipulaciones deseadas en los animales vivos, como el láser basado en la microcirugía, fotoblanqueo y photoconversión.

Para estudiar eventos longitudinalmente más de un período de tiempo más largo en un solo animal, los animales pueden ser colocados en el chip y la imagen varias veces, separadas por períodos de descanso. Placas de agar zumo de uva son ideales para el descanso entre sesiones de formación de imágenes, ya que proporcionan una fuente de alimento fácil y humedad. Varias sesiones de proyección de imagen sí afectan la supervivencia larvaria hasta cierto punto, ya que cada sesión tiene cierto riesgo de dañar el animal (véase la parte 2 en la solución de problemas, más adelante). Los animales pueden ser reflejados de manera rutinaria> 5 veces en el transcurso de dos días con una tasa de supervivencia mayor que 50%. Dado que los animales no son anestesiados, que están sanos y móviles inmediatamente después de la liberación del vacío en el chip. No hay por tanto necesidad de tiempo de recuperación entre las sesiones de formación de imágenes, por lo que la separación de tiempo entre las sesiones es flexible y se puede ajustar a los objetivos del experimento.

Solución de problemas:

La técnica más común esdemanda a con chip de larva y soluciones recomendadas son las siguientes:

(1) El animal se está moviendo demasiado. El exceso de movilidad puede interferir con los objetivos de formación de imágenes. Las razones más comunes para esto en el chip de la larva son: a) el animal es demasiado pequeño para el chip, o b) se ve comprometida la presión de vacío aplicada durante la etapa de inmovilización. El chip larva se describe en este protocolo está diseñado para etapas temprana larvas 3 ^rd. El tamaño óptimo para el animal es de 3.5-4 mm de largo (a lo largo del eje anteroposterior). Para asegurarse de que la presión de vacío es suficiente, tire las jeringas 2-2,5 ml, o hasta que se sienta resistencia en el mango. Una indicación de que el vacío está trabajando es que las pequeñas burbujas en el canal de perímetro se pueden ver se mueve lentamente hacia la fuente de vacío. Otra indicación es que el cubreobjetos siempre debe viajar con el chip cuando el chip se levanta desde la parte superior (y este es el método recomendado para el transporte de la cámarauna vez que las larvas se coloca y el vacío es en). El vacío puede verse comprometida si hay grietas en los tubos, o si hay aceite en el tubo. Esto puede ser fácilmente dirigida mediante la sustitución de la 23 G dispensación punta de la aguja y tubo de polietileno-50 (de los pasos 1.6 a 1.14).

(2) El animal muere después de la impresión en el chip. El procedimiento está destinado a causar el mínimo estrés en el animal, y los animales de tipo salvaje genotipo tienen una tasa de supervivencia> 90%, incluso después de una hora de la inmovilización en el chip ^12. Dado que algunos genotipos pueden ser menos resistentes a la tensión del chip, compruebe primero que los animales de tipo salvaje (por ejemplo, Canton S) sobreviven a la técnica de inmovilización. a) La causa más común de la letalidad es el posicionamiento correctos de la larva (véanse las Figuras 2G-H). Si partes de la cutícula, la cabeza o la tráquea no son del todo dentro de la cámara, entonces pueden ser dañados durante la inmovilización, y unalarva que es demasiado grande para el chip (> 4 mm) es menos probabilidades de sobrevivir. b) Una causa menos común para la letalidad es el uso de un exceso de presión o de vacío cuando se carga el chip. Cuando se coloca correctamente en el chip, la presión generada por el vacío es bien tolerado. Sin embargo una presión excesiva, ya sea desde el vacío o en la etapa inicial de la colocación del animal puede ser un problema. Lo mejor es aprender el grado de presión que se necesita empíricamente mediante ensayos con larvas de tipo salvaje del tamaño correcto. c) Si demasiado Halocarbono cubre la tráquea del animal, el animal puede potencialmente tener problemas con la supervivencia a largo plazo. El aceite desempeña varias funciones importantes en el chip: es importante para la creación del vacío, la óptica durante la proyección de imagen, y contrarresta la desecación en el chip. Sin embargo excesiva de aceite debe ser evitado. (Esto también puede conducir a aceite en el tubo y la jeringa, comprometer el vacío). Las capas de protocolo sugerido sólo el lado ventral de la larva con aceite, entonces Removes exceso de aceite de la colocación de la larva en un cubreobjetos limpio antes de ser transferido a la cubreobjetos final para obtención de imágenes. d) fototoxicidad puede ser experimentado de la sesión de imágenes. Al igual que con cualquier aplicación de imagen en vivo, es ideal para utilizar tiempos de exposición cortos con baja intensidad de luz láser, que se logra mejor usando una cámara de alta sensibilidad o detector. Trate de minimizar la iluminación con luz UV, incluyendo la luz de amplio espectro creado por las fuentes de luz de mercurio.

Otras cuestiones y direcciones futuras:

Dado que este método no utiliza anestesia, el corazón del animal sigue latiendo. Esto crea una cierta movilidad inevitable, que afecta a la imagen en algunos lugares más que otros. Los ejemplos aquí presentados demuestran que el cable ventral del nervio, nervios segmentarios, y la pared del cuerpo se pueden obtener imágenes fácilmente sin la interferencia de los latidos del corazón. En los casos en que el latido del corazón afecta de formación de imágenes, los movimientos regulares a veces pueden ser corregidos para conen el software de análisis (por ejemplo, el estabilizador de imagen plug-in para ImageJ). Esto funciona bien cuando uno de los objetos se están moviendo en una escala de tiempo rápida (por ejemplo, ~ 1 m / seg para el transporte axonal rápido) o en una escala de tiempo muy lento (minutos a horas). Sin embargo, cuando el objeto (s) de interés se mueven con una gama de velocidades y direcciones, puede ser más difícil de corregir para los movimientos inducidos por los latidos del corazón.

Otra cuestión es ligera variabilidad en la óptica de animal a animal, o entre múltiples sesiones de formación de imágenes del mismo animal en el chip. El más profundo es el objeto de interés es dentro del animal, la mayor esta variación será. Nervios segmentarios y el cordón nervioso ventral son normalmente demasiado profundo dentro de entonces los animales en ser fotografiado en un microscopio regular. Sin embargo la presión leve con experiencia en el chip de la larva empuja estas estructuras muy cerca de la cutícula y cubreobjetos. La distancia exacta de estas estructuras del cubreobjetos tendrá pequeñas variaciones de trIAL a juicio. La variación de los objetos de cerca de la cutícula, tales como los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, es menor. Por tanto, es importante, en particular para la toma de mediciones de intensidad, de utilizar un gran número de animales y ensayos independientes para dar cuenta de la variabilidad en la óptica.

Si bien los ejemplos que se muestran aquí se han centrado en los procesos dentro de las neuronas, el enfoque debe ser susceptibles de obtener imágenes de cualquier estructura en el animal que puede ser interpuesto dentro de la profundidad de enfoque del objetivo del microscopio. Esto incluye la cutícula, músculos de la pared corporal, y sus NMJs. Tráquea en el lado ventral del animal y potencialmente partes del tracto digestivo también pueden obtenerse imágenes. El animal también puede ser colocado con el lado dorsal hacia el cubreobjetos para imágenes a corto plazo de las estructuras cerca de la superficie dorsal. La capacidad de estructuras de la imagen profundo dentro del animal está limitada por la distancia de trabajo del objetivo del microscopio utilizado. Estructuras tales como imdiscos aginal son inaccesibles para gran aumento (por ejemplo, 40X) objetivos.

Los chips larva descritos en este protocolo se han diseñado para las larvas en la fase temprana ^º estadio 3 (que varían en tamaño desde 3,5 hasta 4 mm). Sin embargo, muchas preguntas interesantes requieren de imágenes en diferentes etapas larvales. Virutas más pequeñas para dar cabida a 2 ^ª instar larvas, o los chips más grandes para dar cabida a finales de los estadios 3 ^rd pueden ser fácilmente diseñados utilizando el mismo principio. (Figura 1 contiene un archivo DXF fácilmente modificable para la fabricación de moldes de silicona con tamaños de cámara alterados). El principio simple de la junta reversible, incluso se podría aplicar a otros organismos, tales como C. elegans o el pez cebra, con la variante principal que es el tamaño de la cámara. Una dirección futura útil es diseñar un chip que puede inmovilizar a muchos animales a la vez, a utilizar para fines de selección. Sin embargo, para esto, el diseño tendría que ser significativamente diferentedesde el dispositivo actual, en que los problemas de posicionamiento del animal en el chip tiene que ser tratado de forma independiente para cada animal.

El ensayo de aplastamiento del nervio para el estudio de las respuestas de lesiones en los nervios periféricos de larvas:

El ensayo de aplastamiento del nervio descrito aquí para los nervios segmentarios larvas es un método simple para la introducción de una lesión en axones periféricos en Drosophila. Las ventajas de este método incluyen: a) que es simple de llevar a cabo con herramientas estándar que se encuentran en un laboratorio de Drosophila (una fuente de CO y fórceps estereomicroscopio _2), b) puede llevarse a cabo rápidamente para muchos animales, por lo que el análisis bioquímico de cordones nerviosos después de la lesión factible ^14; c) las respuestas moleculares y celulares a esta lesión son altamente reproducibles ^14,15,28 y se pueden utilizar para descubrir los procesos que también son importantes en las neuronas de vertebrados ^29,30.

Métodos alternativos para lesionar neuronas es focusa láser de alta potencia, por ejemplo un UV pulsada o láser de femtosegundo, para cortar un axón mediante microcirugía láser ^17,31-33. El chip larva es un método ideal para el posicionamiento del animal para tales microcirugía. Sin embargo, debido a las diferencias de menor importancia en la óptica entre los ensayos, expuestos anteriormente, el método basado en láser puede ser más difícil de reproducir en las larvas, en particular en los nervios segmentarios de larvas. Además, la lesión axonal láser basado requiere más tiempo para posicionar cada animal, por lo tanto, es más difícil de llevar a cabo a gran escala (con un gran número de animales).

Solución de problemas:

El problema técnico más comúnmente encontrado en el aplastamiento del nervio es la muerte por daños en los órganos internos. Al llevar a cabo la aglomeración, es importante no pellizcar el cable ventral de nervios, glándulas salivales, o los intestinos. También es importante no perforar la cutícula. Estas cuestiones son mejor evitar poniendo los fórceps en un ángulo de 45 º respecto a la superfi cutículaE (véase la Figura 3).

La calidad de las pinzas tiene un gran impacto sobre la eficacia de la aglomeración y la supervivencia después. Recomendamos número Dumostar 5 fórceps. Para conservar su nitidez, las pinzas se deben manejar con cuidado, no se utilizan para otros fines, y reemplazados una vez que se conviertan en roma o doblada.

El tamaño del animal también puede influir en la eficacia de la aglomeración. Los animales pequeños (de menos de 3 mm de longitud) son mucho menos propensos a sobrevivir a la lesión. Con animales de gran tamaño, (deambular 3 estadios ^rd), es más difícil localizar los nervios y evitar daño a las glándulas salivales mayores y los intestinos, y hay menos tiempo para estudiar las respuestas de lesiones antes de la fase de pupa. El aplastamiento del nervio se lleva a cabo con mayor eficacia en el estadio las larvas ³ de principios (que son ~ 3-4.5 mm de longitud a lo largo del eje anteroposterior).

La fuente de alimento que el animal se eleva sobre puede afectar a lafuerza de la cutícula y la supervivencia después de la aglomeración. Se recomienda para criar animales en los alimentos elaborados a partir de una receta estándar de levadura-glucosa.

El mejor método para aprender a hacer la aglomeración eficaz es practicar en muchos animales, primero con el objetivo principal de lograr la supervivencia (y no la fase de pupa) 24 horas después de la aglomeración. Los principiantes suelen tener una baja tasa de supervivencia (por ejemplo, 10%), pero una vez que se aprende la técnica, las tasas de supervivencia pueden alcanzar ~ 90%.

Otras cuestiones y direcciones futuras:

El ensayo de aplastamiento proporciona un método potente para estudiar el surgimiento de axón proximal al sitio de la lesión y la degeneración de los axones y sinapsis distales al sitio de la lesión. Si bien las tasas de degeneración varían entre diferentes tipos de neuronas, que son altamente reproducibles dentro de un tipo de neurona dada, proporcionando testimonio de la reproducibilidad del ensayo de lesión.

En contraste, la 'regenerativa' brotaciónrespuesta observada en los axones proximales es más difícil de estudiar. Todos los axones en el nervio segmentaria inician extensa brotación cerca del sitio de la lesión (por ejemplo, ver la Figura 6 y la Figura 3). Sin embargo, el grado de germinación puede variar de una neurona a otra, y es difícil de cuantificar. Un grado y la variabilidad similar en la brotación se pueden observar después de las lesiones más focales de motoneuronas individuales en los nervios segmentarios introducidas por el uso de un UV láser de colorante pulsado. Interpretamos que la direccionalidad nondiscriminate del brote se debe a la ausencia de señales de orientación en los nervios segmentarios. En contraste, los axones de las neuronas sensoriales lesionados por láser cerca de sus cuerpos celulares se someten a un nuevo crecimiento axonal en la misma dirección que el axón perdido ^34. Los axones en esta región del animal están probablemente expuestos a la información posicional más específico para la orientación de los axones en regeneración. El ambiente dentro de los nervios segmentarios es poco probable que tenga mucho resemblance con el medio ambiente que los axones originalmente navegado durante su orientación en el embrión, por lo tanto, no se espera que tenga información para guiar los axones en regeneración.

Otra limitación para el estudio de la regeneración utilizando el ensayo de aplastamiento del nervio segmentario es que los axones sensoriales y motoneuronas lesionadas tienen todavía una distancia considerable para cubrir (0,25-1 mm) para alcanzar su objetivo, y un marco de tiempo limitado (<3 días) antes de que las experimenta con animales pupación. Un estudio reciente ha identificado una manipulación genética del receptor de la hormona prothoraciotropic que triplica la duración de la fase larvaria 3 ^º estadio ^35. Esta manipulación se extenderá el plazo para el estudio de la recuperación y la degeneración de las neuronas después de la lesión de manera significativa, a 9 en lugar de 3 días. Esto puede ser lo suficientemente largo para observar los nuevos eventos, como la reconexión de un axón lesionado con su objetivo postsináptica, especialmente si la lesión es inducida cerca del final sináptica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de polietileno de 0,5 mm	Fisher Scientific	14-170-11B	Tubo de polietileno, diámetro interno = 0,023 pulgadas de diámetro exterior = 0,038 pulgadas
1 mm Tubo de poliuretano	Fisher Scientific	BB521-63 Tubo de	poliuretano, diámetro interno = 0,063 pulgadas de diámetro exterior = 0,125 pulgadas
Conector de lengüeta a lengüeta	Bio Rad	732-8300	0,8 mm Conector de lengüeta a lengüeta
Válvula de paso de 3 vías	Bio Rad	732-8104	Válvula de rosca para la jeringa Jeringa
(20 ml)	Fisher Scientific	14-817-33	Jeringa de rosca de 20 ml para generar vacío
Agujas dispensadoras, 23 g (0,4 mm de diámetro interior, 0,6 mm de diámetro exterior)	McMaster-Carr	75165A684	Aguja para conexión de salida
Agujas dosificadoras, 21 g, (0,6 mm de diámetro interior,   0,8 mm de diámetro exterior)	McMaster-Carr	75165A679	Aguja para conexión de salida
Aceite de halocarbono	Sigma	H8898	Aceite de halocarbono 700
Pinzas Dumostar Número 5	Roboz	RS-498	Para trituración de nervios
Kit PDMS (Base y agente de curado)	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard 184 Kit Encapsulante de Silicona 0,5 kg
Cubreobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-544-C	24 mm x 40 mm (grosor según recomendación para su objetivo de microscopio)
Vaso de plástico desechable (9 oz)
Palo
de café Cuchilla de afeitar
uva			Ver http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 para la receta