Un procedimiento para la implantación de matrices Organizados de Microhilos para grabaciones de una sola unidad en Awake, Comportarse Animales

Resumen

La implantación de arreglos organizados de microhilos para su uso en una sola unidad los registros electrofisiológicos se presenta una serie de desafíos técnicos. Se describen los métodos para llevar a cabo esta técnica y el equipo necesario. Además, se discute el uso beneficioso de arrays microhilo organizados para grabar desde subregiones neuronales distintas con alta selectividad espacial.

Resumen

En vivo registros electrofisiológicos en el despierto, comportándose animales proporcionan un poderoso método para comprender la señalización neuronal a nivel de una sola célula. La técnica permite que los experimentadores para examinar temporal y regionalmente patrones de descarga específicos con el fin de correlacionar los potenciales de acción grabado con el comportamiento en curso. Además, las grabaciones de una sola unidad se pueden combinar con una plétora de otras técnicas con el fin de producir explicaciones completas de la función neural. En este artículo se describe la anestesia y la preparación para la implantación de micro-hilo. Posteriormente, enumeramos los equipos necesarios y los pasos quirúrgicos para insertar correctamente una matriz micro-hilo en una estructura de destino. Por último, se describe brevemente el equipo utilizado para grabar desde cada electrodo individual en la matriz. Las matrices Microwire fijos descritos son muy adecuadas para la implantación crónica-y permiten grabaciones longitudinales de datos neurales en casi cualquier preparati del comportamientoen. Se discute el rastreo pistas de electrodos para triangular posiciones microhilo, así como maneras de combinar la implantación de micro-hilo con técnicas inmunohistoquímicas con el fin de aumentar la especificidad anatómica de los resultados registrados.

Introducción

Los registros electrofisiológicos permiten a los científicos para examinar las propiedades eléctricas de las células biológicas. En el sistema nervioso central, donde los impulsos eléctricos sirven como un mecanismo de señalización, estas grabaciones son de particular importancia para la comprensión de la función neural ^1-2. Durante las grabaciones de una sola unidad de comportarse animales, un microelectrodo que se ha insertado en el cerebro es capaz de registrar los cambios en la generación de una neurona de potenciales de acción en el tiempo.

Mientras que muchas técnicas permiten una para registrar la actividad cerebral, de una sola unidad de electrofisiología es uno de los métodos más precisos, permitiendo la resolución a nivel de la neurona individual. Cuando se desea un alto grado de especificidad espacial, microhilos se pueden utilizar para apuntar a los sub-conjuntos de núcleos o células dentro de la Brain3 discretas. Grabaciones de una sola unidad también se benefician de una alta resolución temporal como grabaciones son exactas a nivel de microsegundos. Y, in vivo unagrabaciones vigilia permiten interacciones circuitos intactos, con el medio natural de aferentes y eferentes proyecciones, química sistémica y las influencias hormonales, y los parámetros fisiológicos. Las señales nerviosas se derivan de la entrada sensorial, comportamientos motores, el procesamiento cognitivo, la neuroquímica / farmacología, o alguna combinación. En consecuencia, la segregación de los motores, cognitivos, sensoriales y químicas influencias requiere experimentos bien diseñados con riesgos y controles efectivos que permitan la evaluación de cada una de las influencias mencionadas. Con todo, las grabaciones en comportarse animales permiten experimentadores para observar la integración de múltiples fuentes de información dentro de un circuito de funcionamiento y para derivar un modelo más completo de la función del circuito.

Grabaciones de una sola unidad también sufren de un número de desventajas de las cuales cualquier experimentador debe ser consciente. En primer lugar, las grabaciones pueden ser difíciles de llevar a cabo. De hecho, las propiedades de thamplificadores headstage e y los microhilos implantados que permiten la especificidad espacial y temporal en estas grabaciones también hace grabaciones susceptibles a la influencia de las señales eléctricas extraños (es decir, "de ruido" eléctrica). En consecuencia, la capacidad de solucionar problemas en un sistema electrofisiológico requiere una comprensión técnica bien desarrollada de principios y aparatos electrofisiológicos. También es importante tener en cuenta que, bajo ciertas circunstancias, las señales eléctricas registradas en grabaciones extracelulares pueden representar la suma de múltiples señales neuronales. Además, la generalización de la actividad de una sola unidad de actividad de la población dentro de una región objetivo a menudo puede ser limitado por el grado de heterogeneidad celular dentro de la región de destino (pero ver Cardin ^4). Por ejemplo, los electrodos pueden estar sesgados hacia la grabación de las neuronas de salida de alta amplitud en lugar de otras células. La interpretación de las grabaciones de una sola unidad se incrementamediante la combinación de grabaciones con otras técnicas, incluyendo, pero no limitado a, eléctrica (ortodrómica o antidrómica), estimulación química (por ejemplo, iontoforética o receptor de diseñador) o optogenético ^4, inactivaciones neuronales temporales, exámenes sensoriomotoras ^5, procedimientos de desconexión, o inmunohistoquímica ^3.

En el protocolo que sigue vamos a enumerar los materiales y los pasos necesarios para implantar una matriz microhilo organizada en la rata (aunque el protocolo puede ser adaptado para su uso en otras especies). El procedimiento y el estilo de arreglos fijos utilizados en nuestro laboratorio han demostrado ser fiable para grabaciones longitudinal y pueden sostener grabaciones de la misma neurona durante más tiempo con un mes de ^6-8. Esto hace que este procedimiento ideal para examinar las respuestas fásicas a los estímulos experimentales, cambios plásticos en las respuestas neuronales o mecanismos de aprendizaje y motivación.

Protocolo

El mayor cuidado se debe tomar para mantener las condiciones de asepsia (como se describe en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ^9), mientras que la preparación y la realización del procedimiento siguiente. El siguiente protocolo se encuentra en cumplimiento de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y ha sido aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional de la Universidad de Rutgers. Se estima que los procedimientos subsiguientes requerirán 3-6 horas para completar.

La implantación de la matriz Microwire:

1. Coloque los animales bajo anestesia utilizando 50 mg / kg de pentobarbital de sodio (IP) y administrar 10 mg / kg de nitrato de atropina de metilo (IP; glicopirrolato puede estar sustituido) y 0,25 mg de penicilina (300.000 U / ml IM) para mantener la función respiratoria y prevenir la infección , respectivamente.
   Nota: Con la longitud 06.03 horas de esta cirugía de implantación, pentobarbital de sodio se utiliza, ya que es rentable y limita la exposición humana aanestésicos (como podría ocurrir con el uso prolongado de los anestésicos de gas) sin dejar de ofrecer la anestesia de larga duración. La sustitución de otros anestésicos es aceptable.
2. Verifique que la anestesia ha hecho efecto mediante la prueba de presión de la cola antes de proceder.
3. Según sea necesario, dar alterna inyecciones de clorhidrato de ketamina (60 mg / kg ip) y pentobarbital sódico (5-10 mg / kg IP) para mantener la anestesia durante la cirugía.
4. Afeitar el cuero cabelludo con una hoja de bisturí # 22.
5. Desinfectar el cuero cabelludo rapado con povidona yodada.
6. Dar inyecciones subcutáneas de bupivacaína (~ 1 mg / kg SC, repartidas en 4 puntos de inyección) para anestesiar localmente el cuero cabelludo. Permitir 5-10 minutos para que el anestésico local para entrar en vigor.
7. Coloque un lubricante oftálmico sobre los ojos para mantener la humedad durante la anestesia.
8. Asegure el animal en las barras de oído y pinza nariz de un aparato estereotáxico.
9. Use puntos de referencia visuales (por ejemplo, una barra horizontal en la stermarco eotaxic) para nivelar aproximadamente la cabeza del animal. Este paso sólo es para aproximadamente a nivel del cráneo.
10. Hacer una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo usando un hoja de bisturí # 11 montado en un soporte de escalpelo. La incisión debe extenderse desde justo detrás de las orejas a la parte posterior del hueso nasal.
11. Usando una espátula de disección, desactive el cráneo de todo el tejido restante hasta que se hayan alcanzado los dos cantos laterales del cráneo y el cráneo cresta posterior.
12. Tire hacia atrás de la piel alrededor de la incisión utilizando una serie de pinzas hemostáticas (6x).
13. Limpie el cráneo de sangre y deje que se seque. Si se produce un sangrado restante, terminar el sangrado residual con una pequeña herramienta de cauterización. Asegurar que el cráneo se mantiene limpio y seco permite que el acrílico dental utilizado en las etapas posteriores para unirse al cráneo de forma permanente.
14. Marcar bregma y lambda (Figura 2D) mediante la interpolación de la intersección de las suturas del cráneo. Un micrófono de disecciónroscope es necesario marcar con exactitud estas posiciones.
15. Coloque un pequeño objeto puntiagudo (por ejemplo, un alfiler o broca dental) a un brazo estereotáxica y bajarla para determinar el dorsal / ventral (DV) de coordenadas de bregma y lambda.
16. Ajustar la pinza de nariz hasta que el DV coordenadas de bregma y lambda se encuentran dentro de 100 micras (0,1 mm) de cada otra.
17. Una vez estabilizado, registre la anterior / posterior (AP), medial / lateral (ML) y DV Coordenadas bregma junto con la posición de la pinza de nariz. Doble Vea las coordenadas de precisión, como el resto de la cirugía depende de la precisión de estas coordenadas.
18. Utilice las coordenadas medidas para calcular el ML y AP coordenadas de las cuatro esquinas de la "ventana de cráneo" en relación a bregma (es decir, la craneotomía, Figura 1). La ventana de cráneo es un rectángulo situado precisamente a través del cual pasará la matriz micro-hilo.
19. Utilice las coordenadas calculadas para marcar elventana cráneo coordina en el cráneo usando un accesorio estereotáxica en punta y la tinta de la pluma estilográfica. Para obtener marcas precisas, aplicar sólo una pequeña cantidad de tinta a la punta de la herramienta de marcado usando un aplicador de algodón.
20. Taladrar la ventana cráneo mediante la eliminación de la médula en una serie de pequeñas capas.
    1. Comience por la perforación de los marcados esquinas de la ventana donde se han colocado las marcas.
    2. A continuación, conecte las esquinas y delinear la ventana.
    3. Finalmente, limpiar el área dentro de la línea abajo a la profundidad de la duramadre. El orificio debe ser más ancha (es decir, biselado) por debajo de las capas superficiales del cráneo para asegurarse de que la ventana mantiene una anchura apropiada de arriba a abajo.
21. Utilice microforceps para quitar cuidadosamente las virutas cualquier hueso restante, escombros, o duramadre dentro de la ventana de cráneo. Este paso es muy importante, ya que estos trozos de material pueden comprometer la integridad de la matriz durante el descenso. Una vez aprobado, se debe tener the ventana húmeda con solución salina bacteriostática para el resto de la cirugía.
22. Coloque las marcas en el cráneo durante 5 tornillos de cráneo y 1 cable de tierra (Figura 1). Estas posiciones pueden variar dependiendo de la región del cerebro específica. El headstage será más segura si un tornillo se coloca en cada uno de los 5 huesos del cráneo. Coloque los dos tornillos de cráneo y el cable de tierra en lugares que no interfieran con la colocación de matriz micro-hilo.
23. Perforar agujeros para los tornillos del cráneo y asegurar los tornillos en su lugar. Los tornillos deben reducirse hasta sólo 3-4 hilos están mostrando (o, si se utiliza tornillos que no sean los recomendados, lo suficientemente profundo como para atravesar el grosor del cráneo para promover la estabilidad matriz, pero no muy profundo con el fin de dañar la corteza). Limpie las roscas de los tornillos después de la colocación.
24. Haga un agujero para el cable de tierra. Baje el hilo lentamente (durante 1-2 minutos) a la toma DV objetivo coordinar y fijar el cable en su lugar usando el acrílico dental.
25. Añadir acrílico alrededor de las roscasde los tornillos del cráneo. Antes de que se seque el acrílico, eliminar el exceso de cemento que fluye lejos del cable de tierra o los tornillos del cráneo. Permita 15 minutos para el acrílico dental para secar / endurecen.
26. Fije el conjunto al brazo estereotáxica. Nivel la matriz y orientarla de modo que será en ángulo recto pasar a través de los límites de la ventana de cráneo.
27. Coloque la solución salina en la ventana del cráneo para que esté al nivel del cráneo. Baje la matriz hasta que se crea un hoyuelo en la solución salina. Esta cota se utiliza como nivel de cráneo para la matriz. Utilice este valor para calcular el DV última coordenada de la matriz.
28. Baje el conjunto lentamente hasta que alcanza su DV cota final. Parar cada 1 mm de bajada y esperar varios minutos con el fin de permitir que el tejido cerebral se recupere de formación de hoyuelos y para disolver la parte inferior del glicol de polietileno (PEG) en la matriz (PEG se utiliza para mantener temporalmente los cables en su conformación al tiempo que reduce , y se disuelve lentamente en solución salina).
29. Cuando la matriz es de 1 mmlejos de la meta, lo baja más lentamente hasta que se alcance el objetivo final. La reducción en 0,1 hasta 0,2 mm a la vez antes de permitir que el tejido para descansar por un período de 5 min se destina a preservar el tejido en el lugar de destino, así como las conexiones sinápticas proximales. Si el equipo está disponible, precisión descenso de la matriz puede ser asistido mediante un manipulador motorizado.
30. Disolver el resto PEG y utilizar acrílico dental para cimentar los microhilos en su lugar. Añadir múltiples capas de cemento para asegurar que los cables son seguras y luego permitir 15-20 minutos para que el cemento se endurece antes de continuar. Esto asegura que los cables no se empujaban de su colocación final.
31. Construir el resto de headstage del animal usando el acrílico dental. Utilice el acrílico para envolver los tornillos cráneo, cable de tierra, y un conector para los microhilos. Deje que el sombrero de acrílico se endurezca lo suficiente antes de continuar.
32. La sutura de la incisión del cuero cabelludo usando suturas absorbibles y administrar 2 ml of salina bacteriostática (sc) para restaurar la hidratación de la cirugía.
33. Retire el animal de los bares del oído y coloque el objeto en un lugar limpio. Observar el animal con frecuencia durante la recuperación post-operatoria hasta la termorregulación y la locomoción se han recuperado. Después de la recuperación de la anestesia, mover al animal en el alojamiento individual por el resto de la recuperación post-quirúrgica.
34. Ofrecer a los animales monitoreo postoperatorio diaria y el cuidado en los días posteriores al procedimiento. La recuperación de este procedimiento es óptimo cuando siete o más días son permitidos.
35. Ofrecer a los animales inyecciones de Carprofeno (5mg/kg) y enrofloxacina (5-10 mg / kg) o sus equivalentes durante la recuperación por el programa recomendado por el veterinario a cargo.

Resultados

Una lista de los equipos utilizados por este laboratorio para la grabación de señales electrofisiológicas se puede encontrar en la Tabla 3. Tras la recuperación de la cirugía, unidades únicas son registradas por el taponamiento de headstage de ganancia unitaria en el conector implantado. Este headstage está conectado a través de un cable a un conmutador, que es capaz de rotación libre sin roturas en el registro electrofisiológico a través del uso de anillos deslizantes eléctricos. El conmutador permite ...

Discusión

Registros extracelulares representan una técnica experimental de gran alcance que puede incorporarse en casi cualquier preparación experimental en la neurociencia. Cables que han sido implantados en matrices organizados pueden ser rastreados como sus ejes pasan a través del cerebro y en su región diana (Figura 5A). Cuando se crea una lesión pequeña, post-experimental en la punta no aislada microhilo para crear un pequeño depósito de hierro del alambre de acero inoxidable, se puede marcar con precisión l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tabla 1. Lista de Materiales Quirúrgicos.
	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Hisopos de algodón	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropina Nitrato de Metilo	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacina)	Butler Shein ( Bayer)	1040007
Clorhidrato de ketamina	Butler	Shein SKU# 023061
Betadine (Povidona-Yodo)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Modelo 900
Herramienta de cauterización	Stoelting	59017
Microscopio de disección	Nikon	SMZ445
taladro dental	Buffalo	37800
solución salina bacteriostática	bulter Schein	8973
Jewlers Tornillos	Stoelting	51457
Microwire Array	Microsondas	Custom (Flexible)
Ground Wire	Omnetics	Custom Plug
Dental Acrylic Fisher	(BAS)	50-854-402
Suturas absorbibles	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (ungüento/lubricante oftalámico)	Fisher (Henry Schein)	008897
Tabla 2. Lista de Instrumentos Quirúrgicos.
2x Microfórceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multiusos (por ejemplo, limpieza de escombros en la ventana del cráneo)
2x Pinzas	George Tiemann Co.	#160-93	Multiusos (por ejemplo, suturas de unión)
6x Hemostáticos	George Tiemann Co.	#105-1125	Pinza e incisión abierta
1x Tijeras pequeñas	George Tiemann Co.	#105-411	Cortar suturas después de atar
1x Pinzas de tejido	George Tiemann Co.	#105-222	Sujetar el tejido mientras se sutura
1x Portaagujas	George Tiemann Co.	#105-1259	Aguja de sutura de sujeción
1x Soporte de bisturí (con hoja #11)	George Tiemann Co.	#105-80 (con hoja #105-71)	Haciendo incisión
el cráneo 1x #22 Hoja de bisturí George	Tiemann Co.	#160-381	Afeitado del cuero cabelludo
1x Espátula quirúrgica	George Tiemann Co.	#160-718	Raspado del cráneo para limpiar el tejido en el cráneo
Tornillos de máquina/joyeros	varios	N/A	0/80 x 1/8"
Tabla 3. Lista de equipos para el registro de señales electrofisiológicas.
Microwire Array & Conector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Nº de pieza basado en las características de la matriz)	Implantado cranealmente en la región de grabación objetivo. Las matrices se personalizan en función del espaciado de cables deseado, la longitud, etc.
Arnés de Unidad-Ganancia/Headstage	M.B. Diseños llave en mano (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Amplificación inicial de la señal neuronal; permite la propagación de pequeñas señales neuronales.
Conmutador (y giratorio de fluido opcional)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Permite que los animales giren libremente mientras propagan la señal eléctrica al preamplificador
	Preamplificador M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Amplifica diferencialmente las señales neuronales contra un electrodo de referencia.
Filtro y amplificador	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	El paso de banda filtra y amplifica aún más la señal amplificada diferencialmente.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)Ejecuta	software y hardware para la adquisición de datos neuronales y de comportamiento.
Tarjeta A/D	Traducción de datos (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitaliza señales neuronales para muestreo informático.
de tarjetas de E/S digitales	(Norton, MA)	PCI CTR-05	Adquiere entradas y salidas de comportamiento

fuerte en Computación de medición