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Artículo de método

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

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DOI:

10.3791/51017

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24 de octubre de 2013

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1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Resumen

La degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD) se utiliza comúnmente en roedores y en pez cebra y daños a la varilla fotorreceptores de los conos. En el pez cebra adulto, degeneración de los fotorreceptores activa las células gliales de Müller para volver a entrar en el ciclo celular y la producción de progenitores transitoria-amplificación. Estos progenitores continúan proliferando a medida que migran a la zona dañada, donde se dan lugar en última instancia a nuevos fotorreceptores. Actualmente, hay dos paradigmas LIRD ampliamente utilizados, cada uno de los cuales da como resultado diversos grados de pérdida de fotorreceptores y las correspondientes diferencias en la respuesta de la regeneración. Como herramientas más genéticos y farmacológicos están disponibles para probar el papel de los genes individuales de interés durante la regeneración, hay una necesidad de desarrollar un paradigma LIRD robusta. Aquí se describe un protocolo LIRD que resulta en la pérdida generalizada y coherente de ambos fotorreceptores de los bastones y conos en el que hemos combinado el uso de dos técnicas LIRD previamente establecidos. Además, Este protocolo se puede extender para su uso en animales pigmentados, que elimina la necesidad de mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios LIRD.

Introducción

La degeneración retiniana inducida por la luz (LIRD) se utiliza comúnmente en roedores y en pez cebra y daños a la varilla fotorreceptores de los conos. En el pez cebra adulto, degeneración de los fotorreceptores activa las células gliales de Müller para volver a entrar en el ciclo celular y la producción de progenitores transitoria-amplificación. Estos progenitores continúan proliferando a medida que migran a la zona dañada, donde se dan lugar en última instancia a nuevos fotorreceptores. Actualmente, hay dos paradigmas LIRD ampliamente utilizados, cada uno de los cuales da como resultado diversos grados de pérdida de fotorreceptores y las correspondientes diferencias en la respuesta de la regeneración. Como herramientas más genéticos y farmacológicos están disponibles para probar el papel de los genes individuales de interés durante la regeneración, hay una necesidad de desarrollar un paradigma LIRD robusta. Aquí se describe un protocolo LIRD que resulta en la pérdida generalizada y coherente de ambos fotorreceptores de los bastones y conos en el que hemos combinado el uso de dos técnicas LIRD previamente establecidos. Además, Este protocolo se puede extender para su uso en animales pigmentados, que elimina la necesidad de mantener las líneas transgénicas de interés en el fondo albino para estudios LIRD.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo fue aprobado por el comité de la utilización de animales en la Facultad de Medicina de Wayne State University.

1. Adaptación a la oscuridad

  1. Transferencia ~ 10 peces adultos albino o pigmentado del sistema de vivienda normal en un recinto oscuro. Si está disponible, utilizar un recinto oscuro que está integrado en el módulo de vivienda pez cebra, que permite el flujo normal de agua a través del tanque. (Si tal sistema no está disponible, colocar el tanque de peces en un recinto completamente oscuro, asegurándose de airear el pescado con el oxígeno).
  2. Mantener a los peces en la oscuridad durante 10 días. Cuando la alimentación de los animales o la adición de nuevos peces a la caja oscura, asegúrese de avanzar lo más rápidamente posible para evitar la exposición de los peces a un largo período de luz.

2. Exposición a la luz UV

  1. Asegúrese de que la alimentación de la fuente de radiación UV es OFF. Retire el filamento de la luz UV fluorescentes estereoscópica.
    1. Use un invertida15 cm de diámetro de cristal placa de Petri (o algo parecido a 2 cm de altura) como soporte para el filamento UV. Tape la placa de Petri para la mesa del laboratorio.
    2. Tape el filamento de luz UV al principio del plato invertido Petri. Organizar de manera que ~ 2 mm del extremo de los salientes de filamentos de la placa de Petri.
  2. Obtener un vaso de 250 ml de vidrio. Cubra la mitad de la parte inferior, lados, y la parte posterior del vaso de precipitados con papel de aluminio, asegurándose de que el lado "brillante" de la lámina se enfrenta al interior del vaso de precipitados. Si se graduó el vaso, cubrir la mitad redactado del vaso con papel de aluminio, dejando el claro de la mitad de la copa expuesta.
  3. Llenar el vaso de precipitados de 250 ml con 100 ml de agua del sistema de instalación de peces.
  4. Coloque el vaso de 250 ml en un vaso de precipitados de 4 l. Llenar el vaso con 4 L de agua hasta que el nivel del agua está aún con la línea de agua de 100 ml en el vaso de 250 ml.
  5. Añadir un máximo de 10 animales tratados oscuro al vaso de 250 ml. Cubrir el vaso de 250 ml con una pequeña pieza de aluminiopapel de aluminio.
  6. Colocar todo el aparato vaso de precipitados inmediatamente adyacente al filamento UV. El filamento debe estar en contacto con el exterior del vaso de precipitados de 4 L y frente a la parte expuesta del vaso de precipitados de 250 ml. Asegúrese de que el vaso de precipitados de 250 ml se centra en la parte inferior del vaso de precipitados de 4 l.
  7. Coloque una grande, detrás de la pantalla opaca vaso de precipitados de 4 l, lo que permite a los animales a ser expuestos, pero la prevención de cualquier personal de laboratorio de ver la punta del filamento de UV. ADVERTENCIA: asegúrese de que esta barrera es en su lugar antes de conectar la alimentación a la fuente de UV.
  8. Encienda la fuente de alimentación de UV. Ajuste del temporizador durante 30 min. Coloque lo que las etiquetas de advertencia necesarias para asegurar que el personal de laboratorio desprevenidos no querer exponerse a la radiación UV.
  9. Después de 30 minutos, apague la fuente de energía UV. Retire el vaso de 250 ml con el pescado. NOTA: si se requieren múltiples rondas de exposición UV, vamos a la fuente de alimentación se enfríe (~ 20 min) antes de repetir el protocolo de exposición. Asegúrese de sustituir tque 100 ml de agua con sistema de agua dulce para cada exposición. El agua en el vaso de precipitados de 4 L no necesita ser reemplazado.

3. Halógena luz de la lámpara de exposición

  1. Transferir el pescado de 250 ml vaso en un claro L pecera 1.8 acrílico. Llenar el depósito hasta la marca de desbordamiento.
  2. Configure la lámpara de luz halógena área de tratamiento. Obtener cuatro 250 W Lámparas halógenas de servicios públicos en una ferretería local. Frente a dos lámparas en la misma dirección, organizar 29 cm de distancia en el centro. Colocar los otros dos lámparas en una manera similar.
    1. Coloque el segundo conjunto de lámparas de modo que se enfrentan a la primera serie de lámparas, dejando ~ 73 cm entre los dos conjuntos de lámparas. Esto crea un área de tratamiento de la luz en forma de rectángulo de 29 x 73 cm.
  3. Obtener un pequeño ventilador en una ferretería local. Coloque el ventilador equidistante entre los dos conjuntos de lámparas, a las afueras de la zona de tratamiento de la luz.
  4. Coloque dos 1.8 L tanques llenos de agua en el centro de laárea de tratamiento de la luz, a medio camino entre los dos conjuntos de lámparas. La distancia entre las lámparas y la pared exterior del tanque debe ser ~ 29 cm. Nota: aunque sólo el tratamiento de 10 peces en un tanque de 1.8 L, utilice este arreglo. Se necesitan tanto los tanques para mantener la temperatura del agua de cada tanque dentro del rango apropiado.
  5. Coloque un aireador de oxígeno en cada tanque.
  6. Cubra cada tanque con tapas de acrílico transparente, dejando una brecha de ~ 2 cm en el extremo más cercano al ventilador. Organizar el ventilador para que sople aire dentro de este vacío. Coloque un termómetro en uno o ambos de los tanques.
  7. Encienda la energía a las luces, ventiladores, y aireadores. Mantener el tratamiento de la luz para un máximo de 4 días. El pescado no debe ser alimentado durante el tratamiento de la luz, ya que esto afectará la calidad del agua y dar lugar a más estrés a los animales.
  8. Controle la temperatura y del nivel del agua sobre una base diaria. Mantener la temperatura a 30-33 ° C. Si es necesario, ajustar la velocidad del ventilador y / o la distancia entre los tanques y la lilos dere.
    1. Remate de cada tanque de agua de la instalación, según sea necesario, por lo general todos los días.
    2. Siempre use pez cebra adulto sano (típicamente 6-9 meses de edad) para mantener una tasa de supervivencia de cerca de 100%. Sin embargo, si un pez es encontrado muerto en el tanque, retire inmediatamente y reemplazar el agua en todo el tanque.

4. Colección de tejidos

  1. 48 horas después de la aparición del tratamiento con luz halógeno eliminar el pescado de la zona de tratamiento.
    1. Preparar fijador formaldehído etanólico fresca (1 parte de 37% de formaldehído, 9 partes de etanol 100%).
    2. La eutanasia de pez cebra con una sobredosis anestésica de 2-fenoxietanol (0,4 mg / L).
    3. Transferir el pez cebra eutanasia a una toalla de papel. Enucleación del ojo utilizando pinzas curvas.
    4. Coloque ojos enucleados en fijador y almacenar O / N a 4 ° C.
  2. Cryoprotect los ojos.
    1. Lavar los ojos en 5% de sacarosa 1x PBS durante 30 min a temperatura ambiente, a continuación, reemplazar confresca 5% de sacarosa 1x PBS durante 2 hr. A continuación, lavar los ojos en el 30% de sacarosa 1x PBS O / N a 4 ° C. Lavar los ojos en una mezcla 1:1 (partes iguales) de medio de congelación tisular y 30% de sacarosa 1x PBS O / N a 4 ° C.
  3. Insertar los ojos en el 100% de medio de congelación de tejido y se almacenan a -80 ° C. Oriente los ojos de manera que cryosectioning del tejido se realiza en el eje dorsal / ventral.
  4. Cryosection el tejido y el lugar en portaobjetos de vidrio. Diapositivas caliente durante 2 horas a 55 ° C. Diapositivas Almacenar a -80 ° C o realizar inmediatamente inmunohistoquímica estándar.
  5. Realizar inmunohistoquímica estándar sobre el tejido seccionado y la imagen con microscopía de fluorescencia 40,51.

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Resultados

El protocolo de tratamiento de la luz hasta ahora descrito se comparó con cada método de LIRD. En los animales albinos adultos tratados con oscuro (Figuras 3-5), los tratamientos de luz individuales dieron como resultado una pérdida significativa de la varilla (figura 3) y el cono (Figura 4) fotorreceptores. Sin embargo, ambos tratamientos individuales dañados principalmente fotorreceptores en la mitad dorsal de la retina, dejando la retina ventral relativament...

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Discusión

Aquí nos muestran que la combinación de una exposición a UV corta con una luz brillante continua exposición resulta en la pérdida de fotorreceptores extendida y una respuesta robusta regeneración. En comparación con los métodos LIRD individuales, este método combinado es también el protocolo más eficaz para dañar los dos conos y bastones en ambas mitades de la retina. Es importante destacar que este tratamiento es eficaz en animales pigmentadas, así como animales albinos.

A pesar de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Xixia Luo excelente para la cría de peces y soporte técnico. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R21EY019401 (RT) y P30EY04068 (RT), y los fondos de puesta en marcha a la temperatura ambiente, incluida una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera a la Universidad Estatal de Wayne, Departamento de Oftalmología. JT fue apoyado por una beca Thomas C. Rumble proporcionado por la Escuela de Graduados de la Universidad Estatal Wayne.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fuente de luz ultravioletaLeicaEL600
Placa de Petri de vidrio (150 x 20 mm)Sigma-Aldrich/PyrexCLS3160152BO
250 ml Vaso de precipitados de vidrioSigma-Aldrich/PyrexCLS1000250
4 LSigma-Aldrich/Pyrex
Papel de aluminioFisher01-213-105
250 W halógeno lámparasWorkforce265-669
Tanques de acrílico transparente de 1,8 LAquaneeringZT180T
1.8 L tapas de tanque de acrílico transparenteAquaneeringde ZT180LCL
HoneywellHT-900
Aireador Tetra77853-900
TermómetroCole-ParmerYO-08008-58
Bent pinza (5/45)World Precision Instruments504155
CLS10004L Ventilador

Referencias

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