Simulación de páncreas Neuroplasticidad:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurona Plasticidad Ensayo

Resumen

Plasticidad neuronal es una característica de la (GI) tracto gastrointestinal cada vez más reconocido, pero insuficientemente entendida. Aquí, en el ejemplo de trastornos pancreáticos humanos, se presenta un ensayo de neuroplasticidad in vitro para el estudio de la plasticidad neuronal en el tracto GI, tanto a nivel morfológico y funcional.

Resumen

La neuroplasticidad es una característica inherente del sistema y gastrointestinal (GI) inervación nervioso entérico en condiciones patológicas. Sin embargo, el papel fisiopatológico de la neuroplasticidad en trastornos GI sigue siendo desconocido. Modelos experimentales novedosas que permiten la simulación y la modulación de la neuroplasticidad GI pueden permitir una mayor apreciación de la contribución de la neuroplasticidad en particular las enfermedades gastrointestinales, como el cáncer de páncreas (CP) y la pancreatitis crónica (PC). Aquí, se presenta un protocolo para la simulación de la neuroplasticidad de páncreas en condiciones in vitro utilizando recién nacido ganglios dorsales de rata raíz (DRG) y el plexo mientérico (MP) neuronas. Este enfoque de doble neurona no sólo permite la monitorización de tanto la neuroplasticidad-órgano intrínseca y extrínseca-, pero también representa una herramienta valiosa para evaluar la morfología neuronal y glial y electrofisiología. Además, permite la modulación funcional de contenidos microambientales suministrados por el estudio de su impact en la neuroplasticidad. Una vez establecido, el presente ensayo neuroplasticidad tiene el potencial de ser aplicable al estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.

Introducción

Las alteraciones en la gastrointestinal (GI) morfología del nervio y la densidad han llamado la atención de los gastroenterólogos y patólogos durante mucho tiempo, pero su relevancia para la fisiopatología de las enfermedades gastrointestinales se desconoce ^1-3. De hecho, varios trastornos GI altamente comunes tales como la gastritis, la esofagitis de reflujo, la colitis, diverticulitis y apendicitis se asocian con el aumento de la densidad de inervación en áreas tejido inflamado ^1. Sin embargo, hasta ahora no se ha prestado atención real a los mecanismos y significado de la neuroplasticidad en el tracto GI. ¿Los nervios GI morfológicamente alterados difieren de los nervios normales GI, es decir, el estado normal del sistema nervioso entérico, en términos de su función? ¿Cuáles son las implicaciones de la alteración del contenido de neuropéptido / neurotransmisor en los nervios entéricos de plástico? ¿Tiene la neuroplasticidad periférica siempre implica la señalización alterada para el sistema nervioso central? ¿Y dónde están las proyecciones centrales de extri plásticovías neurales GI NSIC? Una larga serie de tales preguntas clave se puede generar fácilmente cuando se mira a la escasez de nuestros conocimientos sobre los aspectos funcionales de la neuroplasticidad GI.

El estudio de la neuroplasticidad GI a nivel funcional requiere modelos experimentales válidos, reproducibles y todavía fácilmente aplicables. En una era de creciente popularidad y la aceptación de modelos de ingeniería genética condicionales de ratón (GECoMM), como en entornos in vivo tienen el potencial para dilucidar aspectos hasta ahora desconocidos de la neuroplasticidad GI de una manera realista ^1. Sin embargo, el diseño y la producción de GECoMM sigue siendo costoso, laborioso y, sobre todo, requiere mucho tiempo. Además, requieren la selección a priori del objetivo a ser modulada condicionalmente en el ratón alterado genéticamente (por ejemplo, la sobreexpresión transgénica de factor de crecimiento nervioso / NGF en células epiteliales intestinales). Por lo tanto, para la design de un GECoMM éxito, los investigadores necesitan algunos indicadores (por ejemplo, datos experimentales anteriores) de un objetivo que vale la pena, es decir, que la molécula de interés (en este caso NGF) por lo menos se puede esperar para ejercer algunos efectos biológicamente relevantes sobre los nervios de GI.

Tales indicadores se puede derivar fácilmente de ser adecuada en modelos in vitro en la que los subtipos de células aisladas del complejo microambiente de un sistema in vivo se pueden cocultured selectivamente de una manera heterotípicos ^4-7. La modulación de dianas moleculares en un ambiente de cultura tan heterotípica es, en promedio, técnicamente menos complicado, más rápido, y por lo tanto puede ayudar en el filtrado previo de las metas que valgan la pena para la verificación de los estudios in vivo.

Recientemente, presentamos un ensayo in vitro neuroplasticidad en el cual fue diseñado para simular el aumento de la densidad neuronal y la hipertrofia de ne intrapancreáticarves en el cáncer de páncreas humano (PCA) y pancreatitis crónica (PC) tejidos. Aquí, las neuronas derivadas de recién nacido dorsal de rata ganglios de la raíz (DRG) o plexo mientérico (MP) se expusieron a extractos de tejido de CaP resecado quirúrgicamente o CP tejidos muestras y se compararon con las cultivadas en el páncreas humano normal (NP) extractos de tejido ^5. En lugar de extractos de tejidos, también se puede utilizar sobrenadantes de líneas celulares para estudiar el impacto de los tipos de células seleccionadas en la neuroplasticidad. Cuando se combina con una medición morfométrica estándar, el ensayo de la neuroplasticidad presentado permite la evaluación válida y reproducible de la plasticidad neuronal en respuesta a diferentes microambientes pancreáticas. Particularmente, se permite la simulación de 1) la neuroplasticidad morfológico, es decir, los cambios en el crecimiento de neuritas, el patrón de ramificación y tamaño neuronal, y 2) la neuroplasticidad funcional, es decir, alteraciones en la excitabilidad de las neuronas periféricas. Por otra parte, no sólo periférica (es decir Entérica), sino también central (por ejemplo DRG o segundo médula orden) las neuronas se pueden incluir en el presente ensayo para evaluar su reacción morfológica y funcional a diferentes contenidos de tejido GI. En el presente video tutorial, se demuestra el protocolo técnico para la realización de este ensayo y se discuten sus ventajas y debilidades. Por otra parte, llamamos la atención sobre la aplicabilidad de la noción básica de este ensayo para el estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales en el protocolo siguen las pautas de cuidado de animales de Technische Universität München, Alemania.

1. Medios / Extracto de Preparación

1. Homogeneización de tejidos
   La calidad de la homogeneización del tejido es fundamental para la posterior detección de alteraciones de plasticidad en las neuronas cultivadas. Aquí, se recomienda un homogeneizador que permite la disociación de tejido sin gran aumento en la temperatura del tejido.
   1. Transferencia de 5 mm x 5 mm x 5 mm cubos de tejido pancreático directamente desde -80 º C en nitrógeno líquido y coloque en una fase sólida en el homogeneizador de tejidos. El homogeneizador ideal sería disociar el tejido lo suficientemente rápido, sin que llegue a descongelar la imagen.
   2. Inmediatamente después de la disociación, resuspender el, homogeneizado de tipo polvo sólido en 300-500 l de 0,1 x de buffer fosfato salino (PBS). En este caso, no utilice ningún buffer de lisis (como RIPA), ya que esto puede lisar las neuronas.
   3. Se centrifuga el homogeneizado durante al menos 15 minutos a la velocidad máxima de su centrífuga de mesa (por ejemplo, 21.130 xg). Recoger el sobrenadante claro que representa el extracto de tejido.
2. Sobrenadantes línea celular
   1. Deje que las células de interés alcancen al menos el 70 - 80% de confluencia en medio de crecimiento normal.
   2. Por lo general, estos medios contienen los componentes del suero y pueden ejercer efectos incontrolables sobre el crecimiento neuronal. Por lo tanto, después de alcanzar la densidad celular deseada, lávese las células por lo menos 3 veces con PBS grado de cultivo de células y colocarlas en un medio libre de suero (SFM) para un máximo de 48 horas.
      Nota: Aquí, consideran que algunas células (como las células estrelladas pancreáticas) pueden necesitar suero en su medio de crecimiento con el fin de mantener su estado y estructura normal. En tales casos, realizar diluciones seriadas de suero en el medio de la célula de interés con el fin de encontrar el contenido más bajo posible de suero necesaria para funcio célula intactan.
   3. Medir la concentración de proteína del homogeneizado de tejido o sobrenadantes de células a través de ensayo de proteínas de Bradford. Mientras que estos valores varían dependiendo del tejido y tipo celular, para los extractos de tejido pancreático, uno podría esperar un intervalo de concentración entre 5-12 g / l, y para sobrenadantes de líneas celulares entre 3-8 g / l.

2. Extractos alícuotas y sobrenadantes celulares

Dependiendo de la concentración para ser utilizado en el ensayo, la concentración final del extracto sobrenadante o en el medio neuronal debe ser de 100 mg / ml de ^5,8.

Nota: Para un ensayo con las neuronas crecen en 500 l de medio en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, se necesita 50 g de proteína de cada extracto o sobrenadante por pocillo. A una concentración de extracto típico de alrededor de 10 g / l, se necesitaría 5 l de extracto / sobrenadante de cada pocillo. En cada setting realizado como triplicado, esto correspondería a 15 l de extracto / sobrenadante. Para tejidos o de células diferentes tipos, realizar diluciones en serie del extracto final o la concentración de sobrenadante y comparar los efectos neurotróficos observadas entre las diferentes concentraciones de extracto / sobrenadante.

3. Aislamiento de Neuronas

Una vez que la recolección de extraer / sobrenadante está terminado, continuar con el aislamiento de las neuronas.

1. Para las neuronas DRG, recoger el cuello uterino para lumbar DRG de ratas recién nacidas entre el día postnatal (P) 2-12 después de la decapitación y disección estereomicroscópica de DRG (Figura 1A). Con el fin de tener las neuronas DRG suficientes para una placa de 24 pocillos, recoja toda la cervical a lumbar DRG de una rata recién nacido (que equivale a 52 DRG) por plato.
   1. Recorte el periférico (nervios) y las proyecciones centrales (raíces) de DRG a través de micro tijeras.
      Dejando las proyecciones en el lugar impide la trituración y aumenta tque la contaminación del riesgo de la cultura por los fibroblastos.
2. Para neuronas MP, cortar el mesenterio del intestino delgado y manualmente y tira con cuidado la capa de seromuscular del intestino delgado (para un protocolo detallado en el aislamiento MP, consulte Schäfer et al. ^9, Figura 1B). Para MP, recoger el plexo de dos ratas por 24 pozos de la placa.
   Nota: Trate de ser lo más suave posible para evitar roturas en la capa seromuscular ya que impiden el éxito de su separación del intestino delgado.
3. Recoger el DRG y la capa seromuscular en medio esencial mínimo enfriado con hielo (MEM) suministrado con gentamicina (20 mg en un medio de 500 ml) y metronidazol (2,5 mg en 500 ml de medio).
4. Tras la recogida de DRG, los incuban en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) suministrado con colagenasa de tipo II durante 20-30 min. Para el aislamiento MP, incubar en colagenasa tipo entre 1-3 horas, dependiendo de la edaddel animal (Figura 1C).
5. Para MP, recoger las reticulares MP pedazos bajo microscopio estereoscópico y traslado al MEM helada.
6. Luego se tritura el DRG y MP a través de jeringas con diámetro decreciente.
   Nota: trituración excesiva puede destruir las neuronas, pero menos que las células de la glia.
7. Una vez que el medio que contiene el DRG o MP se ha convertido en nublado, centrifugar la suspensión a 93,9 xg durante 5 min, se elimina el medio y volver a suspender en medio Neurobasal (suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina y 2% B-27).
8. Contar el número total de células (es decir, neuronas y células gliales) por medio de un hemocitómetro.
   Nota: El número de células necesarias depende del parámetro de medición. Para la cuantificación de la densidad de neuritas, uno necesita las culturas más densas y por lo tanto un mayor número de células que para la medición del crecimiento de neuritas, el tamaño perikaryonaly el patrón de ramificación de las neuronas individuales. Para mediciones de la densidad de neuritas, utilizar por ejemplo 10.000 células (neuronas glia +) / pocillo o 1500 neuronas / pocillo. Para la morfometría de las neuronas individuales, breve (1 minutos de duración) tripsinación de las células y la siembra de 2.500 células / pocillo o 400 neuronas / así se recomienda. El rendimiento típico de células obtenidas de una rata es de alrededor de 300.000-500.000 células.
9. Seed las células en cubreobjetos de 13 mm que se han recubierto la noche anterior y arriba los pocillos con medio Neurobasal (suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0.5 mM de L-glutamina y 2% de B-27) (figura 1D).
   Nota: El uso de poli-D-lisina (40 mg / m ²⁾ O-ornitina y laminina cubreobjetos recubiertos (1 mg / ml cada una) recubiertas. Las células se adhieren a poli-D-lisina extremadamente rápido, por lo que es adecuado para experimentos en los que se necesitan muchas células (es decir, medidas de densidad de neuritas). El apego a la laminina es de alguna generaleslo más débil, pero la laminina es un fuerte promotor del crecimiento de neuritas. Por lo tanto, para mediciones en la ramificación neuronal y la longitud de las neuritas, prefieren ornitina / laminina-recubrimiento.
10. Permitir que las células se adhieren a los pozos durante la noche. Al día siguiente, la preparación de los medios de comunicación de extracto suplementado (a una concentración de extracto / sobrenadante final de 100 g / ml).
11. Aspirar el medio de siembra, y realizar una, de lavado muy suave opcional con PBS, y luego lentamente pipetear los medios de comunicación extracto / sobrenadante suplementado (Figura 1E).
12. Deje que las células crezcan durante 48 horas. Aspirar los medios de comunicación y fijar en el 4% paraformaldehido durante inmunotinción (Figura 1F).
13. Realice doble tinción de inmunofluorescencia usando específica de neuronas (por ejemplo, beta-tubulina III) y específica glia (por ejemplo glial fibriallary proteína ácida / GFAP) marcadores (Figura 1G).
14. Para la morfometría, use un microscopio de luz invertido equipado con una cámara CCD en combinación with software automatizado que permite la medición de la densidad de axones (véase el cuadro).
15. La densidad de axones de cultivos neuronales se mide en 4-5 microfotografías representativas a 200 aumentos de 4 regiones diferentes de crecimiento más denso en cada cubreobjetos mediante la superposición de un 50 micras x 50 micras rejilla y contar la densidad de las fibras por metro cuadrado medido en las fibras de intersección. El crecimiento de neuritas, número de ramas por neurona significa, la longitud de la rama media y tamaño perikaryonal se pueden medir de seleccionados al azar 30 neuronas solitarios de cada cubreobjetos mediante el marcado de las neuritas y perikarya (Figura 1H).

Resultados

Neuroplasticidad morfológica

En el rango de edad indicado de ratas recién nacidas (P2-12) y las densidades de siembra, MP y DRG neuronas ya construir densas redes neuronales después de 48 horas (Figura 2A). Comparación de la densidad de axones entre las neuronas cultivadas en el CP, CP y sus extractos NP revela una mayor densidad de axones de las neuronas DRG en el CP o extractos del PP que en los extractos NP (Figura 2A) ^5. Particularmen...

Discusión

El presente protocolo tiene por objeto ilustrar la metodología detrás del ensayo de la neuroplasticidad pancreática in vitro que fue desarrollado recientemente por nuestro grupo para estudiar los mecanismos de neuroplasticidad en el CP y CP ^5. El protocolo consiste en un procedimiento de tres días que se pueden aplicar fácilmente una vez que el artista intérprete o ejecutante ha adquirido suficiente experiencia en el aislamiento y cultivo de neuronas de DRG y MP. Además, representa una herramienta va...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P1149
Ornitina/laminina	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Cubreobjetos	Merck		Para uso en placas de 24 pocillos
Desmembranador S	Sartorius
Anticuerpo anti-beta-III-tubulina	Millipore	MAB1637	concentración 1:200
Anti-GFAP-anticuerpo	DAKO	M0761	concentración 1:400
Tampón RIPA + inhibidor			Cualquier proveedor
Medio neurobasal	Gibco/Ciencias de la Vida	21103-049
B-27 Suplemento	Gibco/Ciencias de la Vida	17504044	Se sabe que la calidad del B-27 depende del número de lote
Gentamicina/Metronidazol			Cualquiera proveedor
Medio esencial mínimo	Gibco/Ciencias de la Vida	31095-029
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)	Gibco/Ciencias de la Vida	24020133	Mejora la actividad de la colagenasa cuando contiene Ca/Mg
Colagenasa tipo II	Worthington Biochemical	CLS-2	Obtenga lotes con una actividad de al menos 200 U/mg
Tripsina-EDTA 0,25%	Gibco/Ciencias de la Vida	25200056
4% Paraformaldehído			Cualquier proveedor
analySIS docu software	Olympus

de la proteasa