Aplysia Preparación De Ganglios Para Análisis Electrofisiológicos Y Moleculares De Neuronas Individuales

Resumen

El caracol marino Aplysia californica ha sido ampliamente utilizado como modelo neurobiológico para los estudios sobre bases celulares y moleculares del comportamiento. Aquí se describe una metodología para explorar el sistema nervioso de Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de neuronas individuales de circuitos neuronales identificados.

Resumen

Un desafío importante en neurobiología es entender los fundamentos moleculares de los circuitos neuronales que gobiernan un comportamiento específico. Una vez identificados los mecanismos moleculares específicos, se pueden desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para tratar anomalías en comportamientos específicos causadas por enfermedades degenerativas o envejecimiento del sistema nervioso. El caracol marino Aplysia californica es muy adecuado para las investigaciones de las bases celulares y moleculares del comportamiento porque los circuitos neuronales subyacentes a un comportamiento específico podrían determinarse fácilmente y los componentes individuales de los circuitos podrían ser fácilmente manipulados. Estas ventajas de Aplysia han llevado a varios descubrimientos fundamentales de la neurobiología del aprendizaje y de la memoria. Aquí se describe una preparación del sistema nervioso Aplysia para los análisis electrofisiológicos y moleculares de las neuronas individuales. Brevemente, el ganglio diseccionado del sistema nervioso se expone a la proteasa para eliminar la vaina ganglionar de tal manera que las neuronas están expuestas pero conservan la actividad neuronal como en el animal intacto. Esta preparación se utiliza para llevar a cabo mediciones electrofisiológicas de neuronas únicas o múltiples. Es importante destacar que, después de la grabación utilizando una metodología simple, las neuronas podrían aislarse directamente de los ganglios para el análisis de expresión génica. Estos protocolos se utilizaron para llevar a cabo grabaciones electrofisiológicas simultáneas de las neuronas L7 y R15, estudiar su respuesta a la acetilcolina y la cuantificación de la expresión del gen CREB1 en aislados de las neuronas L7, L11, R15 y R2 de Aplysia.

Introducción

El cerebro humano es extraordinariamente complejo con casi 100 mil millones de neuronas y billones de conexiones sinápticas. Hay casi un número igual de células no neuronales que interactúan con las neuronas y regulan su función en el cerebro. Las neuronas se organizan en circuitos que regulan comportamientos específicos. A pesar de los avances en nuestra comprensión de las funciones cerebrales y los circuitos neuronales, poco se sabe sobre la identidad de los componentes de los circuitos que controlan un comportamiento específico. El conocimiento de las identidades de varios componentes de un circuito facilitará grandemente nuestra comprensión de la base celular y mo....

Protocolo

1. Preparación De Ganglios Abdominales, Mediciones Electrofisiológicas, Y El Aislamiento De Las Neuronas Individuales Identificadas Del Ganglio Abdominal De Aplysia californica

1. Mantenga Aplysia en el acuario de laboratorio con agua de mar artificial circulante (ASW) a 16 ° C bajo condiciones de luz: oscuras de 12:12.
2. Aislamiento del ganglio abdominal.
   1. Anestesiar a los animales inyectando 380 mM mgCl₂ solución durante 5-10 min (equivalente al 30-35% del peso corporal del animal).
   2. Identificar el ganglio abdominal en función de su posición en el sistema nervioso central^24,28.
   3. Retira....

Resultados

Los pesos de los animales que fueron utilizados en este estudio se extendieron a partir del 100-200 g. Siguiendo los protocolos descritos, se realizaron mediciones electrofisiológicas y análisis moleculares de neuronas de ganglios abdominales aislados de animales que oscilaban entre 2-5 g y 200-300 g.

La estandarización del tratamiento con proteasa es importante para el éxito de las mediciones electrofisiológicas de las neuronas en los ganglios. Inicialmente, se utilizaron concentraciones y du.......

Discusión

La neurona R15 participa en la regulación de los sistemas cardiovascular, digestivo, respiratorio y reproductivo³⁰. Una actividad que estalla regularmente rítmica del AP es una característica de R15. Como se muestra en la sección de resultados, el registro emparejado de R15 y L7 muestran que la preparación de los ganglios ha preservado la actividad de las neuronas R15. Las neuronas R15 y L7 respondieron apropiadamente a Ach. Esta preparación de los ganglios se podía mantener hasta 8-10 horas y la actividad ele.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aplysia	National Aplysia Resource Facility, Universidad de Miami
NaCl	SIGMA	S 3014-1KG
KCl	SIGMA	P 9333-500G
CaCl2• 2H2O	SIGMA	C5080- 500G
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP 214-501
NaHCO4	SIGMA	S 6297-250G
HEPES	SIGMA	H 3375-500G
Proteasa	GIBCO	17105-042
Trizol	Ambion	15596-026
Chloroform	MP Biomedicals	2194002
100% Etanol	ACROS	64-17-5
GlycoBlue	Ambion	AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5	Ambion	AM9740
Agua libre de nucleasas	Ambion	AM9737
MessageAmp II Kit de amplificación de ARN	Ambion	AM1751
qScript cDNA SuperMix	Quanta Biosciences	95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix Pinzas	Biosystems Applied Bio	4367659
	Fine Science Tools	11252-20
Tijeras	Fine Science Tools	15000-08
Pines Minutien de acero inoxidable	Herramientas de ciencia fina	26002-10 o
26002-20
Termociclador Veriti	Biosystems Applied Biosystems	Centrifugador
Veriti 5430R Centrífuga		Eppendorf	5430R 7900HT
PCR rápida en tiempo real	Biosystems aplicada	7900HT Amplificador de PCR
	BRAMP-01R	NPI Electrónica
Digidata Converter	Instrutech ITC-18	HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulador	Patch Star	Scientifica

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