El ketoconazol se une a y antagoniza pregnano X activación del receptor (PXR). De levadura de alto rendimiento pantallas de mutantes PXR definen una región única para la unión ketoconazol. Este método de genética de la levadura descubre la interacción del receptor nuclear novedosas con ligandos que se asocian con los sitios de unión de la superficie.
Como un regulador crítico de la inflamación y el metabolismo de fármacos, pregnano receptor X (PXR), juega un papel importante en la fisiopatología de la enfermedad que une el metabolismo y la inflamación (por ejemplo, la esteatosis hepática) 1,2. Ha habido muchos avances en la identificación de ligandos agonistas de PXR, sin embargo, hay descripciones limitadas de antagonistas similares a las drogas y sus sitios de unión en PXR 3,4,5. Un obstáculo fundamental ha sido la incapacidad para purificar eficientemente la proteína de longitud completa para estudios estructurales con antagonistas a pesar de que PXR se clonó y caracterizó en 1998. Nuestro laboratorio desarrolló una nueva levadura de alto rendimiento basado en dos híbridos de ensayo para definir un antagonista, ketoconazol de, residuos de unión en PXR 6. Nuestro método implica la creación de bibliotecas mutacionales que rescatar el efecto de mutaciones individuales en la superficie de AF-2 de PXR espera que interactúe con ketoconazol. Rescate o "ganancia de función" second mutaciones pueden realizarse de tal manera que las conclusiones relativas a la interacción genética de ketoconazol y el residuo (s) de superficie en PXR son factibles. Por lo tanto, hemos desarrollado una evaluación de la levadura de dos híbridos de alto rendimiento de mutantes PXR que interactúan con su coactivador, SRC-1. El uso de este enfoque, en el que se modificó la levadura para acomodar el estudio del fármaco antifúngico, ketoconazol, hemos podido demostrar mutaciones específicas en PXR enriquecidos en los clones incapaces de unirse al ketoconazol. Por lógica inversa, llegamos a la conclusión de que los residuos originales son residuos de la interacción directa con ketoconazol. Este ensayo representa una novela, ensayo genético manejable para detectar sitios de unión sobre las superficies antagonistas de receptores nucleares. Este ensayo podría aplicarse a cualquier fármaco, independientemente de su potencial citotóxico a la levadura, así como a la proteína (s) celular que no pueden ser estudiados utilizando la biología estructural estándar o métodos proteómicos basada. Peligros potenciales incluyen la interpretación de los datos (métodos complementarios de utilidad), relición en un solo método Y2H, experiencia en el manejo de la levadura o la realización de dos ensayos de híbridos de levadura, y la optimización del ensayo.
La levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo es ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína y, más recientemente, para el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas que alteran los complejos proteína-proteína de interacción 7, 8, 9, 10, 11. Sin embargo, los enfoques convencionales de este ensayo, que se utiliza para la detección de drogas o "hits", no permiten la detección de residuos de interacción alostéricos de compuestos químicos en las superficies de la proteína-proteína, que cuando se alteran aún interactuar y permitir el interrogatorio de los residuos alterados 11 . De hecho, un método (s) de tal manera, si es factible desarrollar, permitiría un sistema de levadura manejable para la evaluación de alto rendimiento de los residuos de interacción alostéricos críticos para la proteína-proteína interacción interrupción. En el contexto del descubrimiento de fármacos, la forma más directa para establecer la interacción de los compuestos con proteínas implicaría la determinación estructural (por ejemplo, cristalización del complejo de proteína-inhibidor). Estos métodos son cumbersome, utilizar los recursos elaborados y que no sea técnicamente factible realizar estudios estructurales de cada proteína.
Sistemas de detección de drogas genética tratable se han establecido en las bacterias 1, 2 y otros sistemas modelo, como los mamíferos de dos híbridos. Sin embargo, estos sistemas necesitan optimización y sistemas alternativos como Y2H siguen siendo los más probado en el descubrimiento de fármacos. Hay limitaciones que incluyen poca sensibilidad y fiabilidad de las interacciones utilizando métodos singulares 13, sin embargo, un único ensayo Y2H puede ser modificado para responder a preguntas específicas respecto a los residuos de interacción. En el campo de la investigación de los receptores nucleares, Y2H se ha utilizado para definir las proteínas que interactúan 14, sin embargo, estas interacciones proteína rara vez se han utilizado para definir la naturaleza en el que los ligandos / antagonistas interactúan con complejos de proteína de receptor nuclear. Por lo tanto, nuestro laboratorio se centró esfuerzos en la definición de un método, especialmente para proteínas receptoras que no estánque se presta fácilmente a proteómicos métodos basados, eso sería desenterrar nuevo ligando / antagonista interactuar residuos utilizando una plataforma de descubrimiento Y2H basado inversa.
Basándonos en nuestra anterior conclusión de que el ketoconazol altera PXR y su activador SRC-1, hemos desarrollado un novedoso sistema de reversa Y2H que nos permiten definir e interrogar a los residuos de ketoconazol interactuar en PXR 6. Nuestro método se basa en las propiedades de la proteína GAL4 de levadura que consiste en dominios separables responsables de la activación de unión a ADN y la transcripción. La proteína PXR LBD se expresa como una fusión con el dominio de unión a ADN LexA (ADN-BD), mientras que la longitud total co-activadores SRC-1 (coactivador del receptor de esteroides 1) las proteínas se expresan como fusiones al dominio de activación de GAL4 (AD ). Interacción entre PXR y SRC-1 proteínas de fusión conduce a la activación transcripcional de los sitios de unión de GAL4-que contiene el gen reportero de β-Lac Z que está integrado en el Genom levadurae. Ketoconazol, un antagonista de PXR, interrumpe PXR y SRC-1 interacción 15, 16, 17 y que puede detectar la interacción de PXR y SRC-1 en presencia o ausencia de ketoconazol después de la tinción colonias sobre filtros para la actividad de X-gal. El principio de Y2H se ilustra en la Figura 1 y el procedimiento experimental se resume en la Figura 2.
En nuestro ensayo Y2H modificado, hemos identificado los residuos importantes para las interacciones ketoconazol sobre PXR 6. Desde SRC-1 es un coactivador (y se clonó en el vector de pGADNot), también a prueba si SRC-1 podría activar la expresión de lacZ cuando se clona en el sistema de vector PSH y si esto cambiaría el perfil de activación y / o afectar a la permeabilidad de el ensayo de dos híbridos de levadura. Uso de nuestros plásmidos rediseñados que llevamos a cabo dos ensayos de híbridos en …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Otorga CA127231 y el Premio Fundación Damon Runyon Investigador Clínico (IC 1502) (para SM). Nos gustaría dar las gracias al profesor Zdenek Dvorak desde Palacky Universidad de Olomouc, República Checa por sus útiles conocimientos sobre la discusión portabilidad de esta técnica para su institución y estandarización del protocolo.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
BamHI | our lab | R0136 | |
SalI | our lab | R0138 | |
NotI | our lab | R0189 |